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松材线虫病被称为松树的癌症,在我国主要借助松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）传播。因此,有效防治松墨天牛是防控松材线虫病的关键措施之一。然而,作为目前应用最为广泛的微生物杀虫剂,苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在松墨天牛等重要林木蛀干害虫的生物防治领域一直没有得到充分利用和深入研究。有研究表明,对鞘翅目昆虫有特异性活性的Cry3Aa毒素对松墨天牛等蛀干害虫活性较低。而在Cry3Aa毒素发挥毒力的过程中,昆虫中肠蛋白酶对毒素的酶解活化和毒素与受体结合是影响其毒力的关键步骤。为了明确Cry3Aa毒素对松墨天牛幼虫弱毒的主要原因,分别研究了Cry3Aa毒素在松墨天牛幼虫中肠的酶解情况以及与受体结合的情况。接着,为克服Cry3Aa在松墨天牛幼虫中肠存在的酶解活化障碍和过度酶解现象,本研究测定了松墨天牛幼虫中肠主要蛋白酶种类,并对其切割位点进行准确地测定,从而为Cry3Aa毒素改造位点的设计提供理论基础。最后,基于获得的蛋白酶特异性切割位点,对Cry3Aa毒素进行分子改造以促进其在松墨天牛幼虫中肠的酶解活化效率,从而提高其杀虫活性。具体结果如下:首先,为了明确Cry3Aa毒素在松墨天牛幼虫中肠的酶解活化情况,本研究先测定了松墨天牛幼虫肠道的理化性质,结果显示p H值为5-6之间,表明松墨天牛幼虫肠道呈弱酸性环境。然后,利用Western blot技术测定了松墨天牛幼虫中肠蛋白酶对Cry3Aa毒素的体外酶解情况。结果表明,当肠腔酶液和Cry3Aa的质量比较高时（5:1、2:1、和1:1）,Cry3Aa毒素被过度酶解,而肠腔酶液质量降低时,Cry3Aa毒素只有部分被酶解活化为55 k Da活性片段。相反地,无论肠膜酶液质量高低,大多数Cry3Aa毒素未被酶解活化出55 k Da活性片段。在19℃-37℃的反应温度梯度和10 min-16 h的反应时间梯度下,中肠蛋白酶液均只能酶解出少量的55 k Da Cry3Aa活性片段。同时,在强酸性（p H 3.0）条件下松墨天牛幼虫中肠蛋白酶无法酶解Cry3Aa毒素,而在p H 5.0、7.5和10的条件下Cry3Aa毒素可以被正确酶解出55 k Da的活性片段,但活化不完全。此外,Cry3Aa毒素会被三龄幼虫中肠蛋白酶过度酶解,而一龄、二龄和四龄幼虫中肠蛋白酶只能部分酶解出55 k Da Cry3Aa活性片段。综上所述,松墨天牛幼虫中肠蛋白酶对Cry3Aa毒素体外酶解存在的过度酶解和酶解活化障碍是导致Cry3Aa毒素对松墨天牛幼虫弱毒的可能原因。接着,为明确Cry3Aa毒素与松墨天牛幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）上受体蛋白的结合情况,本研究首先利用Binding assay和ELISA技术验证了Cry3Aa毒素能够与松墨天牛幼虫中肠BBMV结合,其解离常数为Kd=247 n M。利用Ligand blot技术测定了Cry3Aa毒素与BBMV的特异性结合,结果显示其结合条带大小为～100、～60、～50、～36、～35和～30 k Da。且转录组测序结果显示松墨天牛幼虫中肠转录本中有73个Bt受体unigenes,包括9个ALP基因,13个APN基因,41个cadherin蛋白基因和10个ABC转运蛋白基因。然后,通过Pull-down和质谱测定分离鉴定到松墨天牛幼虫中肠中Cry3Aa毒素的受体为氨肽氮酶（APN）。然后,将APN基因进行克隆并表达蛋白,利用Far western blot和ELISA测得Cry3Aa毒素能够与APN蛋白特异性结合,且解离常数为Kd=57 n M。以上结果表明,Cry3Aa毒素能够与松墨天牛幼虫中肠的受体蛋白结合。进一步证明,酶解活化障碍和过度酶解现象是导致Cry3Aa毒素对松墨天牛幼虫弱毒的主要原因。然后,为了克服Cry3Aa毒素在松墨天牛幼虫中肠的酶解活化障碍和过度酶解现象,本研究对松墨天牛幼虫中肠蛋白酶种类及其切割位点进行了测定。首先,利用转录组测序技术和荧光底物酶活测定技术测定了松墨天牛幼虫中肠蛋白酶种类,结果显示,在松墨天牛幼虫中肠转录本中共鉴定出159个与蛋白酶相关的unigenes。其中,丝氨酸蛋白酶最多（153个,96.22%）,其次是金属蛋白酶（2个,1.26%）、半胱氨酸蛋白酶（2个,1.26%）和天冬氨酸蛋白酶（2个,1.26%）,且胰蛋白酶（32个,20.92%）和糜蛋白酶（39个,25.49%）是主要的丝氨酸类蛋白酶。此外,荧光底物酶活测定结果显示丝氨酸类蛋白酶抑制剂AEBSF对蛋白酶活性的抑制作用显著,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和金属蛋白酶抑制剂EDTA次之,天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin-A对蛋白酶活性没有显著的抑制作用。说明丝氨酸蛋白酶是天牛幼虫中肠的主要蛋白酶。为了能够为Cry3Aa毒素分子改造位点的设计提供思路以及理论基础,利用多重底物质谱分析法（MSP-MS）技术测定了松墨天牛幼虫中肠蛋白酶的特异性切割位点图谱,结果显示,松墨天牛幼虫中肠蛋白酶在P1位点对精氨酸（R）和赖氨酸（K）具有较高的切割效率,表明松墨天牛幼虫中肠主要的蛋白酶为胰蛋白酶。此外,蛋白酶切割位点大部分位于十四肽的第6-9个氨基酸之间,表明松墨天牛幼虫中肠蛋白酶具有较强的内肽酶活性。因此,对Cry3Aa毒素表面的精氨酸（R）和赖氨酸（K）进行有针对性地改造,则可以有效地解决酶解活化障碍和过度酶解问题。最后,本研究通过分子改造的手段来提高Cry3Aa毒素的杀虫活性。一方面,在Cry3Aa毒素domain I的α-helix 3和α-helix 4之间的loop区域（第155和第157个氨基酸）插入设计的4个能够被胰蛋白酶识别切割的短肽序列（FMR、FMRP、FCKY和FKMW）从而促进毒素的有效酶解,结果显示,Cry3Aa-FMRP和Cry3Aa-FCKY改造毒素的酶解情况与Cry3Aa原毒素相似,酶解活化不完全。与此相反,Cry3Aa-FKMW改造毒素则被中肠蛋白酶液过度酶解活化。Cry3Aa-FMR蛋白在肠腔酶液中被过度酶解,而在肠膜酶液中不能够被完全酶解。同时,生物测定结果显示,Cry3Aa、Cry3Aa-FMRP和Cry3Aa-FKMW毒素的LC50分别为116.8、105.6和167.9μg/m L。而Cry3Aa-FMR和Cry3Aa-FCKY改造毒素对松墨天牛三龄初期幼虫的活性较低无法计算其LC50。表明虽然在Cry3Aa毒素domain I中的α-helix 3和α-helix 4之间的loop区域增加胰蛋白酶识别位点能够改善蛋白酶解的酶解效率,但其杀虫活性没有得到提高,说明毒素的过度酶解极大地影响了其对松墨天牛幼虫的杀虫活性。另一方面,为了克服Cry3Aa毒素的过度酶解现象,本研究在第一步改造的基础上,将位于Cry3Aa毒素非功能区域的赖氨酸（K）、酪氨酸（Y）和苯丙氨酸（F）（丝氨酸类蛋白酶识别位点）突变为丙氨酸（A）从而使毒素不被松墨天牛幼虫中肠蛋白酶过度酶解,Cry3Aa-T改造毒素只对胰蛋白酶识别位点进行突变,Cry3Aa-C改造毒素只对糜蛋白酶识别位点进行突变,Cry3Aa-T-C改造毒素中胰蛋白酶和糜蛋白酶识别位点均突变。结果显示,Cry3Aa-T、Cry3Aa-C、Cry3Aa-T-C三种改造毒素与Cry3Aa原毒素比较,55 k Da活性片段的产量均有所增加,且Cry3Aa-T产生最多55 k Da的活化片段。此外,与Cry3Aa原毒素比较,Cry3Aa-T毒素(LC50=12.3μg/m L)、Cry3Aa-C毒素(LC50=59.6μg/m L)和Cry3Aa-T-C毒素(LC50=91.5μg/m L)对松墨天牛三龄初期幼虫的杀虫活性均有不同程度地提高,其中,Cry3Aa-T毒素对松墨天牛幼虫的毒力提高了近9.5倍。以上结果表明,通过MSP-MS技术测定松墨天牛幼虫中肠蛋白酶的特异性切割位点,进而针对性地对Cry3Aa毒素上的多个特异性酶切位点进行改造可以有效提高其对松墨天牛幼虫的杀虫活性。该策略也可能适用于转基因植物对其他害虫抗性的治理,包括一些农业上的重要害虫。本研究不仅有助于深化对Cry毒素作用机制地认识,还可以为松墨天牛的生物防治提供一条新的途径。