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目的:壬基酚(nonylphenol,NP)是一种广泛使用的化工原料,主要用于合成洗涤剂、造纸、纺织印染、皮革化工、乳液聚合、农药等工业领域。随着经济的飞速发展,我国每年都有大量的壬基酚通过工业“三废”及生活污水进入环境介质。壬基酚具有拟雌激素活性,是典型的环境内分泌干扰物。环境中极低浓度的壬基酚即可通过生物蓄积效应和食物链传递,潜在危害生物体的内分泌、生殖、免疫、神经等多个系统机能。目前,关于雄性动物成年期壬基酚染毒对生殖器官、性激素水平及精子受精功能影响的研究较少,特别是精子顶体相关指标、附睾抗氧化状态及凋亡等方面的研究尚未见报道。本课题通过对成年雄性SD大鼠灌胃染毒,研究壬基酚对大鼠睾丸、附睾和精子的损伤作用,探讨其对雄性大鼠生殖功能的影响及其可能的毒作用机制。方法:32只健康成年SPF级雄性SD大鼠,经适应性饲养1周后,按体重随机分为4组:溶剂对照组(玉米油)和低(40mg/kg)、中(100mg/kg)、高剂量(250mg/kg)壬基酚染毒组,每组8只。从大鼠12周龄开始,采取灌胃方式染毒,容量1.5ml/kg,隔天上午染毒1次,连续90d。(1)一般状况及体重:每日观察动物的饮食和活动情况,注意大鼠被毛、皮肤、眼睛、呼吸以及日常行为方面的变化。隔天称重一次;(2)大鼠处死后,分离双侧睾丸、附睾和附睾尾,称重,并计算相应的脏器系数;(3)苏木素-伊红(HE)染色,观察大鼠睾丸组织病理学改变;(4)腹主动脉采血,分离血清,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清睾酮水平;(5)制备附睾尾精子悬液,利用光学显微镜及活细胞工作站,计数精子浓度、畸形率和活动度;(6)通过使用相应荧光探针和流式细胞技术检测精子存活率、顶体完整性、线粒体膜电位(MMP)和游离钙离子([Ca2+]i)水平;(7)采用改良Kenndy法检测精子顶体酶活性;(8)通过流式细胞仪和荧光染料(H2DCFDA)检测附睾尾精子活性氧(ROS)水平;(9)利用酶联免疫吸附法检测附睾组织抗氧化物酶((超氧化物歧化酶,SOD)和(过氧化氢酶,CAT))活性;(10)使用TUNEL法评估壬基酚对附睾凋亡诱导效应。结果:(1)染毒后,各剂量壬基酚染毒组大鼠均出现精神萎靡、稀便、被毛不舒展、毛发灰暗甚至脱毛现象,组间差异不明显。高剂量组大鼠在灌胃时反抗较强烈,攻击性行为在染毒后期明显增强。各染毒组大鼠体重与溶剂对照组比较,差异均无统计学意义。(2)与溶剂对照组比较,仅低、高壬基酚染毒组大鼠的附睾重量显著下降。各染毒组大鼠睾丸、附睾和附睾尾的脏器系数与溶剂对照组比较,差异均无统计学意义。(3)病理学检查发现,溶剂对照组大鼠睾丸曲细精管排列紧密、结构完整,生精上皮基膜完整,各级生精细胞层排列规则、层次清楚;低剂量壬基酚染毒组曲细精管结构相对规则、大小一致,管间隙略有增大,生精细胞层基本完整;中、高剂量壬基酚染毒组睾丸出现部分曲细精管萎缩、管间隙增大,生精细胞层变薄、结构排列紊乱,管腔内精子细胞数量减少,部分管腔可见脱落的上皮细胞碎片。(4)与溶剂对照组比较,低剂量壬基酚染毒组大鼠血清睾酮水平略有升高,中、高剂量组睾酮水平有所降低,但仅高剂量组睾酮水平降低明显,差异有统计学意义。(5)附睾尾精子计数、活动度随着染毒剂量的增加而逐渐降低,而精子畸形率随着染毒剂量的增加而逐渐升高。与溶剂对照组比较,中、高剂量壬基酚染毒组大鼠附睾尾精子数量显著减少、活动度显著降低、畸形率显著增加。(6)流式细胞仪检测结果显示,与溶剂对照组比较,中、高剂量壬基酚染毒组精子的(PI-/PNA+)%明显升高;高剂量壬基酚染毒组大鼠精子hMMP%显著降低;各剂量壬基酚染毒组大鼠精子存活率和[Ca2+]i水平均无明显变化;随壬基酚染毒剂量的升高,精子顶体完整性和MMP的水平呈逐渐降低的趋势。(7)与溶剂对照组比较,高剂量壬基酚染毒组精子的顶体酶活力下降,差异有统计学意义;随着壬基酚染毒剂量的升高,精子顶体酶活力呈逐渐降低的趋势。(8)与溶剂对照组比较,壬基酚染毒组大鼠精子细胞内ROS水平均有所升高,但仅高剂量组精子ROS显著升高。(9)与溶剂对照组比较,壬基酚染毒组大鼠附睾组织SOD和CAT活性均有所下降,其中低、高剂量组CAT活性以及高剂量组SOD活性均显著下降。(10)TUNEL检测结果显示:各组大鼠附睾组织均见凋亡阳性信号表达,且凋亡细胞主要是退化的附睾管上皮细胞,位于附睾管基底部;与溶剂对照组比较,低、高剂量壬基酚染毒组大鼠附睾组织凋亡阳性细胞百分比显著升高;高剂量组附睾组织凋亡阳性细胞显色强度呈强阳性,其余剂量组凋亡阳性细胞显色强度呈阳性。结论:(1)壬基酚于大鼠成年期在体暴露,可使附睾重量明显下降,提示壬基酚对附睾组织存在损害作用;同时壬基酚染毒对大鼠体重和睾丸重量则未显现出明显的影响。(2)组织病理学检查提示,随壬基酚染毒剂量的增加,睾丸曲细精管损伤程度逐渐加重。(3)壬基酚可导致血清睾酮水平明显降低,提示壬基酚能扰乱内分泌激素水平,从而对雄性生殖系统产生毒性作用。(4)壬基酚暴露可使大鼠附睾尾精子数量显著减少、畸形率显著增加,提示壬基酚可能造成成年雄性生精障碍。(5)壬基酚暴露可影响精子活动度、MMP、顶体完整性及顶体酶活性,表明壬基酚对精子受精功能具有一定损伤作用;但是壬基酚对精子存活率和[Ca2+]i没有明显的影响作用,提示NP对精子受精功能的影响可能不是通过改变[Ca2+]i水平而发挥作用的。(6)壬基酚暴露可升高大鼠附睾尾精子ROS水平,造成精子氧化应激增加。提示,壬基酚所致精子ROS增加可能是影响精子受精功能的机制之一。(7)壬基酚暴露可影响附睾组织SOD和CAT活性,也可诱导附睾组织发生凋亡。提示壬基酚对附睾组织具有一定毒性,可能是造成脏器重量降低及精子功能变化的原因之一。