猪FASN基因的克隆和功能分析

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随着人们对优质猪肉要求的提高,与脂肪性状有关的基因的研究在猪的育种目标中显得日益重要。猪脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)基因是一种基本的代谢酶类基因,脂肪酸合成酶催化乙酰CoA和丙二酸单酰CoA合成软脂酸(16:0),脂肪酸合成酶的含量和活性的高低对动物体脂沉积具有重要作用,进而影响肉质风味。自FASN基因被发现以来,其广泛的生物学作用引起人们巨大的研究兴趣,它们的结构、功能、变异、表达和产物特性已经成为肥胖分子机制研究的热点。 本研究通过比较基因组学、RACE技术、克隆测序、SNP筛查、PCR-RFLP方法、荧光定量方法研究了猪FASN基因结构和功能情况,其中对猪FASN基因3’UTR区T7782C、A7999C点的各种基因型与生产性状进行了关联分析;同时,以广东省地方品种蓝塘猪代表脂肪型猪种,以引入品种长白猪代表瘦肉型猪种,利用荧光定量PCR技术,分五个阶段(1日龄、27日龄、90日龄、150日龄、180日龄)屠宰蓝塘猪与长白猪各六头,对皮下脂肪组织RNA中FASN基因mRNA的相对表达量,并得出了以下结果: (1)根据NCBI登录的猪FASN基因的部分序列电子克隆,设计基因特异性引物,一方面验证,一方面应用RACE方法,快速获得猪FASN基因3’末端cDNA序列。拼接获得猪FASN基因部分805lbp的cDNA序列(登录号:EF589048)。分析可知:猪FASN基因mRNA序列包括7539bp的ORF(位于14bp~7552bp区域),499bp的3’UTR。预测该基因编码2512个氨基酸(登录号:ABR09275)。 (2)应用生物信息学对猪FASN基因编码的氨基酸序列进行分析发现:不同物种FASN基因核苷酸同源性比对分析,与牛的同源性是84%,与人同源性为83%,与小鼠的同源性为87%。猪FASN蛋白质与牛的同源性是88%,与人和小鼠的同源性为87%。通过疏水性区域预测存在多个,最大的疏水性位点分值为2.667。跨膜区域分析结果显示该肽链有55个跨膜区域。应用神经网络算法和隐马氏模型分析该肽链为无信号肽,这和该基因具有组织特异性表达相符。 (3)以大白和蓝塘猪的cDNA为材料,利用PCR产物直接测序筛选可能与猪肉质性状相关的SNP。在猪FASN基因部分cDNA序列3’UTR检测到2个SNP,2个单碱基颠换,其中是T7782C、A7999C位点处的变异。 (4)以PCR-RFLP方法,研究了FASN基因T7782C位点、A7999C位点在长白猪、大白猪、杜洛克猪和蓝塘猪中的多态性分布情况。两个位点所有猪种的基因型分布都偏离哈迪.温伯格平衡定律。 (5)对FASN基因T7782C位点与A7999C位点的PCR-RFLP基因多态性与生产性状进行关联分析发现,T7782C位点与猪的活体重、胴体重、后驱重、皮脂厚、背膘厚、日增重存在显著相关(P<0.05)。 (6)FASN基因mRNA在皮下脂肪组织中的相对表达量除了在1日龄、27日龄外,蓝塘猪均高于长白猪,但前四个阶段,两个品种差异不显著,到第5阶段,两者的差异达到显著水平,但两个品种都无发现明显的性别差异。 (7)长白猪与蓝塘猪FASN基因mRNA相对表达量与胴体重、后躯重、皮脂厚、背膘厚度、肌内脂肪、日增重、油脂重无显著相关关系。
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