论文部分内容阅读
动物克隆技术应用目前所遭遇的瓶颈主要体现在技术效率总体上偏低，早期胚胎死亡率高、妊娠率低，胎儿或克隆动物畸形率高；克隆技术的进一步突破有赖于对存在问题本质的探讨。猪体细胞核移植(SCNT)在加速品种改良、建立动物疾病模型等方面具有广泛的应用前景，在异种器官移植、转基因动物生产方面等也有巨大的应用潜力。虽然SCNT技术已在包括猪在内的多种动物上获得克隆后代，但动物克隆生产的总体效率仍然很低，而猪SCNT的效率尤为低下，严重制约了该技术的进一步发展与应用。要完善猪体细胞克隆技术程序，有必要对克隆胚胎发育过程中所存在的问题进行分析。迄今为止，人们对于克隆胚胎体外发育过程中的细胞凋亡规律，克隆重构胚表观遗传重编程机制等仍知之甚少。本试验以猪体外成熟卵母细胞为材料，系统研究猪体细胞克隆胚胎体外生产关键技术；在优化猪克隆胚胎体外生产程序的基础上，对克隆胚胎体外发育过程中的细胞凋亡及DNA甲基化水平的变化规律进行实验探讨，以期了解猪克隆胚胎在体外发育与凋亡、DNA甲基化水平变化等方面的内在联系，为进一步完善猪体细胞克隆技术体系，提高猪克隆胚胎体外生产效率提供参考依据。本研究共包括以下6个部分：
试验一、猪受体卵母细胞的体外成熟与去核本试验以屠宰场采集的猪卵巢为研究对象，系统比较体外成熟培养液、成熟时间及卵巢生理状态等对猪受体卵母细胞体外成熟与去核的影响，旨在优化猪卵母细胞采集及其体外成熟培养体系，为进一步研究猪体细胞核移植提供优质的受体卵母细胞。用抽吸法采集2～5 mm卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COC)，随机分为3组，比较3种成熟培养液对猪受体卵母细胞体外成熟的影响。结果表明10％新生牛血清(NCS)TCM199与NCSU23(BSA free)组的第一极体(pbⅠ)排出率均显著高于0.1％聚乙烯醇(PVA)TCM199组(79.7％和77.0％对60.2％，P<0.05)；将COC随机分为3组，采用10％NCSTCM199作成熟培养液，分别培养42 h、44 h和46 h，Hoechst33342荧光染色鉴定表明，随着体外成熟时间的延长，pbⅠ与卵母细胞核位置的偏离率逐渐增加，而去核率则逐渐降低，pbⅠ的偏离率与去核率之间呈负相关，体外成熟培养44 h，既能获得较高的pbⅠ排出率(80.3％)，又可保障理想的去核率(82.5％)。分别从卵泡期与黄体期卵巢上收集COC，比较卵巢生理状态对卵母细胞体外成熟的影响，结果显示卵泡期卵巢与黄体期卵巢组间的pbⅠ排出率无显著差异(80.7％对77.9％，P>0.05)，但在去核率上卵泡期卵巢组显著高于黄体期卵巢组(82.5％对72.5％，P<0.05)。本实验结果表明采集卵巢卵泡期COC，以10％NCS TCM199体外成熟培养猪卵母细胞44 h，可获得理想的卵母细胞成熟率和去核率。
试验二、不同来源核供体细胞对猪克隆重构胚发育的影响本实验通过分离培养4种不同来源的猪核供体细胞，即猪胎儿成纤维细胞(pFF)、卵丘细胞(pCC)、颗粒细胞(pGC)及耳成纤维细胞(pEF)，研究比较其生物学特性及对克隆胚胎发育的影响。结果表明，采用组织块法分离培养pFF与pEF，所形成细胞单层的时间分别为6～7 d和9～10 d，采用悬浮细胞接种法培养的pCC与pGC形成单层的时间分别为5～6 d和3～4d；生长曲线与核型分析表明，本实验所分离的4种猪体细胞在前5代，其体外生长特性均能符合体细胞体外生长的一般规律，染色体倍性正常，可作为核移植的供体细胞使用；选用第3代pFF、pCC、pGC及pEF细胞分别进行核移植，比较不同类型细胞对猪体细胞核移植效率的影响，结果显示，以猪pCC为核供体所构建的克隆胚囊胚发育率显著高于其他3组(P<0.05)。本实验表明，所分离的4种核供体细胞在前5代具有正常的体外生长特性，但以卵丘细胞为核供体更有利于克隆胚胎的发育。
试验三、猪体细胞克隆胚胎的体外生产本试验以猪卵丘细胞为核供体构建克隆重构胚，研究电融合/电激活参数和体外培养体系对猪克隆胚胎体外发育的影响，旨在优化体细胞核移植程序，提高猪克隆胚胎体外生产效率。将重构胚随机分组，分别施以不同电场强度(1.0～2.0 kV/cm)、脉冲宽度(20～120μs)和脉冲次数(1～3 DC)，结果表明选用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的参数组合，对猪核移植重构胚进行电融合和电激活，获得最高的囊胚发育率。在体外培养72 h后，半量换液并未改善克隆胚的发育，但添加10％胎牛血清(FBS)可显著提高克隆胚囊胚发育率(15.1％对10.3％，P<0.05)；采用猪卵泡颗粒细胞(pGC)共培养体系未能显著提高克隆胚发育率(P>0.05)，但采用经10μg/mL丝裂霉素灭活的卵丘细胞(pCC)单层共培养可显著提高克隆胚囊胚发育率(26.6％对13.O％，P<0.05)；与体外受精胚胎相比，克隆胚的卵裂率没有显著差异，但其囊胚发育能力仍然较低(24.6％对29.8％，P>0.05)。本实验表明采用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的参数组合进行电融合/电激活后，与丝裂霉素灭活的pCC单层共培养，并在体外培养72 h后添加10％FBS可以显著提高克隆胚的体外发育能力。
试验四、猪克隆胚胎的凋亡分析本试验旨在研究猪SCNT胚胎体外发育过程中的凋亡规律，探讨细胞凋亡与克隆胚胎发育的关系。将体外成熟培养的MⅡ期卵母细胞随机分为2组，分别进行IVF与SCNT处理。以体外受精(in vitro fertilization，IVF)胚胎为对照，采用彗星试验(Comet assay)研究比较猪SCNT胚胎的体外发育与凋亡变化规律。结果表明，猪SCNT胚胎的卵裂率与IVF组无显著差异，而囊胚发育率显著低于IVF组；但与灭活的pCC单层共培养，猪SCNT胚胎的囊胚发育率显著升高(26.6％对13.0％P<0.05)。彗星试验表明SCNT与IVF胚胎的凋亡率均随胚胎发育而呈不断增加的趋势，并在2-细胞期(8.3％对2.1％，P<0.05)与囊胚期(46.2％对26.1％，P<0.05)，SCNT组胚胎的凋亡率显著高于IVF组；但与灭活的pCC单层共培养明显降低了SCNT胚胎囊胚期细胞凋亡率(27.6％对46.2％，P<0.05)。本研究表明猪克隆胚胎生产效率低可能与细胞凋亡有关，但与灭活的pCC单层共培养可明显抑制细胞凋亡，促进克隆胚胎的发育(P<0.05)。彗星试验具有简便、快速、灵敏以及样品需求量少等优点，可以用于检测猪早期胚胎细胞凋亡。
试验五、猪克隆胚胎体外发育过程中凋亡相关基因的表达本试验旨在研究猪SCNT胚胎体外发育与凋亡过程中凋亡相关基因的表达模式，分析猪SCNT胚胎凋亡的分子调控机制。以猪体外受精(IVF)胚胎为对照，采用Real-time RT PCR技术对猪SCNT胚胎不同发育阶段的凋亡相关基因Fas/FasL及Bcl-2 mRNA水平进行相对定量分析。结果表明，在8-细胞期以前，猪IVF与SCNT胚胎的Fas、FasL mRNA一直维持低水平表达，8-细胞以后Fas、FasL mRNA水平均有所升高，且SCNT胚胎升高最为明显，特别是在囊胚期，Fas、FasL mRNA表达量均显著高于IVF组(P<0.05)。随着胚胎的不断发育，IVF与SCNT胚胎的Bcl-2 mRNA表达量均逐渐下降，至囊胚期SCNT胚胎Bcl-2 mRNA水平显著低于IVF组(P<0.05)；与pCC共培养使克隆胚胎囊胚期的Fas/FasL mRNA表达明显下降，并显著提高Bcl-2 mRNA表达水平。本试验表明，猪克隆胚胎体外生产效率低下与胚胎的异常凋亡相关，Fas/FasL系统参与了克隆囊胚阶段的凋亡调控；与猪卵丘细胞共培养可通过影响凋亡相关基因的表达，进而抑制猪SCNT胚胎的凋亡。
试验六、猪克隆胚胎发育过程中DNA甲基化相关基因的表达为探讨猪克隆胚胎体外发育过程中DNA甲基化相关基因表达的变化规律，采用Real-time RT PCR技术对不同发育阶段的猪克隆胚胎DNA甲基转移酶Dnmt1、Dnmt3a mRNA相对表达量进行测定分析。结果发现，SCNT与IVF胚胎发育过程中Dnmt1 mRNA表达具有相似的降低趋势，但IVF胚胎在8-细胞以前的表达量下降更为剧烈，且在4-至8-细胞期的表达量显著低于SCNT胚胎组(P<0.05)。Dnmt3a mRNA在SCNT与IVF胚胎2-至4-细胞阶段均维持较低的表达水平，但从8-细胞期开始，Dnmt3a mRNA表达水平开始逐渐上升，且SCNT胚胎组增加程度更为剧烈，囊胚期的SXNT组Dnmt3a mRNA表达水平均显著高于IVF组(P<0.05)。此外，pCC单层共培养时，克隆胚胎Dnmt1和Dnmt3a mRNA表达并未发生明显的变化。本试验表明，猪克隆胚胎体外发育率低可能与特定发育时期DNA甲基转移酶(Dnmts)基因高表达所导致的供体核不完全重编程有关，pCC单层共培养虽能促进克隆胚胎的发育，但对Dnmts mRNA的高表达模式并无显著影响。