猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是细小病毒科内、细小病毒属中的成员,是可以致使初产的母猪出现繁殖障碍性疾病的重要病原体之一,其主要特征是引起母猪发生流产、产出死胎、木乃伊胎以及引起新生仔猪的死亡。PPV是起初发现于培养猪瘟病毒细胞中的一种小DNA污染性病毒,后来逐渐了解到它是引起胚胎和仔猪出现死亡的重要病因,PPV的基因组是单股负链的DNA,其基因组长约5 kb,主要有两个的开放性阅读框,该病毒基因共编码三种病毒结构蛋白和两种非结构蛋白,分别是VP1、VP2、VP3和NS1、NS2,其中的VP2蛋白是该病毒重要的抗原蛋白,能够有效诱导动物机体产生免疫反应。该病散发于世界各地猪场,20世纪80年代初在我国的不同地区分离到了该病毒,后来证实了本病毒是造成母猪发生繁殖障碍性疾病的重要病原体之一,给世界生猪养殖业带来了严重打击。伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)除了引发新生仔猪出现神经症状之外,还常常使妊娠母猪发生流产,产死胎;同时该病毒还可导致公猪不育,是引发猪群繁殖障碍的又一重要病原体。PRV核酸是双链线状的DNA,其长度为150 kb左右,在病毒基因组上有多个与其复制无关的非必需基因,是常用的活载体之一。因此,本研究将编码PPV结构蛋白中免疫原性较强的VP2基因作为研究对象,以PRV弱毒疫苗株为亲本,构建了能够表达出VP2蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV PGVP2株,为PPV和PRV联合防治提供了有效的理论和技术支持。为了构建可以表达出PPV VP2蛋白的重组PRV弱毒株,本试验用上游引物和下游均引入Bam HI酶切位点的特异性引物扩增VP2基因,纯化回收,测序正确后与经Bam HI酶切并去磷酸化处理后的转移质粒p G相连接,获得重组质粒p GVP2。通过PCR扩增证实了VP2目的片段和该转移载体连接成功,进一步通过酶切试验和序列测定证实了所插入片断为VP2基因片段,而且目的基因片段的连接方向正确。用重组的转移质粒p GVP2和PRV弱毒株DNA共转染ST细胞,通过5次病毒蚀斑纯化并配合PCR检测,获得了纯化的重组病毒rPRV PGVP2株。rPRV PGVP2重组病毒在多种细胞上的增殖试验结果显示,重组病毒在ST细胞中增殖后的病毒滴度与亲本株PRV弱毒株相似,而在VERO细胞和PK-15细胞中的增殖滴度较低,因此ST细胞胞更适合重组病毒的大量培养。重组病毒在ST细胞上的一步法生长曲线显示重组病毒rPRV PGVP2株感染ST细胞后的前10 h,细胞内和上清中的病毒滴度都随着时间的增加而增加,但总体上病毒仍主要存在于细胞内;感染后的第10 h-12 h病毒在上清和细胞内的滴度趋于相等;重组病毒rPRV PGVP2株感染ST细胞12 h以后增殖的重组病毒粒子大量释放到上清中,并于感染后36 h在细胞内和上清中的病毒滴度都趋于恒定;安全性试验结果表明该重组病毒对小鼠是安全的;遗传稳定性试验表明包含有VP2基因的重组伪狂犬病毒的遗传性状比较稳定;RT-PCR、Western blot结果显示插入的基因能够在重组病毒rPRV PGVP2中进行表达。通过这些试验探索了重组病毒的部分生物学特性,为重组病毒的进一步开发利用奠定了基础。在重组病毒株rPRV PGVP2对SPF昆明小白鼠免疫效力的探索中,通过将PRV亲本弱毒株、商品化的PPV灭活疫苗、重组病毒rPRV PGVP2株和DMEM阴性对照分别背部皮下接种6周龄的雌性昆明小白鼠,两周之后再进行一次加强免疫。小鼠免疫后每周尾部采血,获得血清,用ELISA方法检测免疫后小鼠的体液免疫情况;一免后第八周对小鼠外周血中的T淋巴细胞亚群进行检测。每组剩余的5只用PRV强毒进行攻毒试验以检测重组病毒及亲本株对PRV强毒株的保护力。结果显示首免后重组病毒rPRV PGVP2免疫组小鼠体PPV特异性抗体水平很低,但是二免后小鼠PPV特异性抗体水平明显升高;小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定表明重组病毒组能够有效的诱导机体发生细胞免疫反应;攻毒实验表明重组疫苗组和PRV亲本株免疫组均能抵抗PRV强毒的攻击,上述结果表明重组病毒具有成为优良疫苗株的潜力。