【摘 要】
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目的:胃癌是世界第五大常见肿瘤以及第二大肿瘤致死疾病。每年有约951,000新发病例以及723,000死亡患者。超过70%的胃癌发生在发展中国家,超过半数发生在东亚地区（主要在中国）。我国胃癌的流行病学态势尤其严骏。多种因素例如基因背景、幽门螺旋杆菌感染、吸烟、饮食结构等都可以影响胃癌的发生与发展,其中基因水平的调控十分重要,但是我们对胃癌发生发展的潜在机制仍了解不足。心房钠尿肽（ANP）的功能已
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目的:胃癌是世界第五大常见肿瘤以及第二大肿瘤致死疾病。每年有约951,000新发病例以及723,000死亡患者。超过70%的胃癌发生在发展中国家,超过半数发生在东亚地区（主要在中国）。我国胃癌的流行病学态势尤其严骏。多种因素例如基因背景、幽门螺旋杆菌感染、吸烟、饮食结构等都可以影响胃癌的发生与发展,其中基因水平的调控十分重要,但是我们对胃癌发生发展的潜在机制仍了解不足。心房钠尿肽（ANP）的功能已经被广泛研究,研究认为ANP主要由心房肌细胞分泌,对人体的水钠平衡起调节作用。心房钠尿肽受体A（NPRA）是ANP的最主要受体。近年来研究认为ANP-NPRA除了水钠平衡调节作用外还可以参与细胞的增殖等功能调控,同时其在人体胃肠道中有表达,推测其可能具有调控胃癌细胞的生物学功能,且NPRA作为膜受体,有作为治疗靶点的潜力,我们将对NPRA在胃癌中的作用及机制进行研究。方法:构建胃癌组织芯片,通过免疫组化分析NPRA表达量同胃癌临床病理资料之间的联系;根据分析结果,利用体内、体外实验方法评价可能受NPRA影响的生物学功能;通过CCK-8、平板集落形成实验、流式细胞学检测分析NPRA对于胃癌细胞增殖与存活能力的影响;同时利用透射电镜、激光共聚焦显微镜、Western blot检测同肿瘤活细胞数量变化密切相关的自噬功能,并通过在药物及基因水平抑制自噬发动及发挥作用的各个阶段的功能,从而判断自噬对于胃癌细胞是一种保护或是伤作用;通过小鼠皮下移植瘤模型在体内环境下重复上述研究;随后对NPRA发挥其生物学作用所依赖的机制进行研究,通过结果分析以及NPRA的特点,利用JC-1检测线粒体膜电位水平,透射电镜观察线粒体形态,以此评价线粒体功能是否受到影响;利用DHE及DCFHDA染色并HPLC及流式细胞学检测等手段分析NPRA干扰后胃癌细胞内的活性氧（ROS）含量;通过加入ROS抑制剂观察ROS是否可以影响到胃癌的生物学功能,以及是否是NPRA所介导功能调节的上游信号;随后利用Western blot以及信号通路抑制剂观察是何种信号通路介导了上述作用。结果:组织芯片构建及免疫组化分析发现NPRA表达量同胃癌的肿瘤大小,临床分期呈正相关;CCK-8实验及平板集落形成实验发现NPRA干扰后,胃癌细胞的增殖能力下降;流式细胞学检测发现NPRA干扰组细胞的死亡比例明显升高;小鼠移植瘤模型发现NPRA干扰组的小鼠瘤体积减小,生长曲线放缓;Ki-67染色显示核染比例下降,TUNEL实验阳性细胞比例上升。Western blot检测发现NPRA干扰组细胞的LC3-II表达增高,P62表达下降;同时GFP-LC3点状聚集在NPRA干扰组细胞中聚集明显增多;透射电镜检测显示NPRA干扰组细胞中的双层膜结构的自噬体数量增多,表示NPRA干扰后细胞自噬增强。通过氯喹及3-MA在自噬发动的不同阶段抑制自噬,并且通过siRNA干扰自噬相关蛋白ATG5及ATG7的表达以抑制自噬水平,CCK-8及流式细胞学检测发现自噬对于NPRA干扰后的细胞是一种保护性作用。透射电镜检测发现NPRA干扰后可以导致胃癌细胞的线粒体发生肿胀变形,JC-1染色显示线粒体膜电位下降,功能受损;利用DCFHDA染色,流式胞学检测活性氧信号值,NPRA干扰后可以引起细胞内活性氧含量上升;DHE检测并HPLC及荧光观察均得到上述一致结果;在体内、体外环境下下调活性氧含量,活性氧含量降低可以逆转细胞增殖减慢及死亡增多;Western blot分析显示JNK,P38及AMPK通路可以被NPRA干扰所激活,通路抑制及功能实验发现JNK通路介导了 NPRA干扰的抑制细胞增殖及促细胞死亡作用,AMPK可以激活细胞自噬,而P38通路属于被动性激活。结论:NPRA表达量同胃癌的肿瘤大小、临床分期呈正相关,干扰NPRA可以抑制胃癌细胞的增殖、促进胃癌细胞死亡。同时NPRA干扰可以激活细胞保护性的自噬,干扰NPRA表达的同时抑制细胞自噬水平可以更加有效地杀伤胃癌细胞。NPRA干扰可以导致线粒体损伤,后者引起ROS的过度聚集,从而激活细胞自噬及杀伤细胞,ROS通过激活JNK通路抑制胃癌细胞的增殖及存活并通过激活AMPK通路促进胃癌细胞的自噬。
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