论文部分内容阅读
研究背景:细胞衰老,是指细胞的增殖、分化、生理功能等,随着时间的推移而发生衰退的现象。研究认为,端粒的不断缩短、激活的致癌基因、一些细胞因子、活性氧、DNA损伤以及核苷酸损耗等因素均可以引起细胞衰老。细胞衰老涉及到多种生理以及病理过程,包括正常机体发育,伤口愈合,器官功能衰竭以及癌症。细胞衰老的特点主要是细胞的生理完整性逐渐丧失,从而最终导致细胞功能严重受损。XAB2(Xeroderma pigmentosum group A-binding protein 2)是2000年由Kiyoji Tanaka等人首次报道的一个高度保守的多功能基因。研究发现,XAB2参与了例如pre-m RNA的剪接、m RNA的出核转运以及胚胎发育等重要的生物学过程。另报道表明,XAB2在衰老小鼠的造血干细胞中的表达显著下调,提示XAB2参与了细胞衰老的调控过程,然而目前对于XAB2调控细胞衰老的具体机制的认识并不透彻,有待于进一步研究。在真核细胞当中,RNA聚合酶II蛋白质包含了12个亚基,POLR2A(RNA Polymerase II Subunit A)是其中最大的催化亚基,其在转录起始,延伸,暂停以及终止当中均扮演了重要角色。在本实验室之前的研究中,我们发现在He La细胞中敲低XAB2,可以在m RNA水平上显著抑制细胞内POLR2A的表达。在真核生物中,RNA聚合酶II负责转录所有的m RNA以及一些例如sn RNA、sno RNA、si RNA和mi RNA的非编码RNA。RNA聚合酶II包含了12个亚基,POLR2A是其中具有催化功能的最大的亚基。POLR2A位于人染色体17p13.1,它的CTD端分别在转录的起始、暂停、延伸以及终止中均扮演了重要角色。鉴于POLR2A对细胞内的生命活动是必不可少的,它的缺失可能会导致细胞内基因表达的严重失调。由此,我们提出的假说是XAB2可以通过POLR2A调控细胞衰老。带着这样的疑问,我们设计了一系列实验方案,最终通过这一研究将阐明XAB2调控细胞衰老的机制。研究方法:(1)使用H2O2诱导正常人体成纤维细胞HFF1以及MRC5细胞,建立氧化应激细胞衰老模型,利用Western blot探究XAB2以及POLR2A的表达变化。(2)将HFF1细胞不断传代以建立复制性衰老模型,同样利用Western blot探究在复制性衰老细胞中XAB2和POLR2A的表达情况。(3)在动物水平上,利用Western blot比较了14个月龄和11个月龄与1月龄小鼠肺、脑、肝以及心脏组织中POLR2A以及XAB2的表达水平。(4)利用MTT实验,检测敲低XAB2后对HFF1细胞增殖能力的影响。(5)利用流式细胞周期实验,检测敲低XAB2对HFF1细胞周期的影响。(6)通过细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验,检测在HFF1细胞中,由于XAB2或POLR2A缺失而引起的细胞衰老变化。研究结果:(1)在HFF1以及MRC5中成功构建了H2O2诱导的氧化应激细胞衰老模型,并且与对照组相比,XAB2以及POLR2A在蛋白水平的表达显著下降。(2)在HFF1细胞系中成功建立复制性衰老模型,同样利用Western blot发现在复制性衰老细胞中XAB2和POLR2A的表达明显下调。(3)在动物水平上,利用Western blot对比了14个月龄和11个月龄与1月龄小鼠肺、脑、肝以及心脏组织中POLR2A以及XAB2的表达水平,发现随着月龄的增长,小鼠肺、脑以及心脏中XAB2以及POLR2A的表达量发生下调,但在肝脏组织中的表达水平没有明显变化。(4)利用MTT实验证实,在HFF1细胞中敲低XAB2可以显著抑制细胞增殖。(5)利用流式细胞周期试验显示,在HFF1细胞中敲低XAB2后可以将细胞周期阻滞在G2/M期。(6)SA-β-GAL染色实验显示,在HFF1细胞中敲低XAB2以及POLR2A,细胞发生衰老,而且衰老相关的蛋白p53和p21的表达水平明显上升。(7)细胞衰老的恢复实验显示,在敲低了XAB2的HFF1细胞中外源性过表达POLR2A能够部分逆转敲低XAB2导致的细胞衰老。研究结论:研究中我们通过正常人体成纤维细胞中建立好的氧化应激诱导的细胞衰老模型、复制性细胞衰老模型,发现了XAB2以及POLR2A与存在一定的关系。另外,我们在衰老小鼠的肺、脑、心脏组织中发现XAB2以及POLR2A的表达均有所下降。同时,我们还发现XAB2对细胞增殖以及细胞周期均有一定调控作用。最后,我们得出结论,细胞中XAB2可以通过影响POLR2A的表达调控细胞衰老。