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研究背景:随着纳米技术不断发展,纳米材料的应用也逐渐增加。纳米ZnO颗粒具有特殊的物理化学特性,因此在食品和化妆品等领域均有应用。纳米ZnO颗粒进入机体后,能够通过血脑屏障,并进入大脑,因此纳米颗粒的暴露,可能导致神经系统炎症,甚至引起神经退行性疾病。炎症小体被认为与多种炎症性疾病有关,其中包括神经退行性疾病。现阶段纳米ZnO颗粒引起炎症小体激活的相关研究相对较少。因此,探索纳米ZnO颗粒对炎症小体激活的影响,对纳米颗粒安全性具有重要意义。本研究以小胶质细胞为研究对象,分析纳米ZnO颗粒对NLRP3炎症小体激活的影响,并探讨其可能机制,为纳米ZnO颗粒的安全使用提供研究依据。研究目的:1.对纳米ZnO颗粒进行表征,测定纳米ZnO颗粒的粒径,多分散系数及Zeta电位。2.研究纳米ZnO颗粒对BV2细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)释放和炎症因子分泌水平的影响,探究纳米ZnO颗粒对NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平的影响。3.探究TLR4/My D88/NF-κB信号通路在纳米ZnO颗粒诱导的NLRP3炎症小体激活中的作用。4.探究纳米ZnO颗粒对溶酶体的损伤,并探究纳米ZnO颗粒诱导的溶酶体损伤对NLRP3炎症小体激活的影响。研究方法:1.采用透射电子显微镜,分析纳米ZnO颗粒的形貌;使用马尔文粒径仪测定纳米ZnO颗粒平均水合粒径大小、多分散系数及Zeta电位。2.纳米ZnO颗粒(0,2.5,5.0,10.0,15.0,20.0μg/m L)处理BV2细胞24h后,采用MTT法测定细胞存活率;采用比色法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶的水平;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清中白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的分泌水平;采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)测定各组中NLRP3、pro-caspase-1、ASC和caspase-1蛋白表达水平。3.纳米ZnO颗粒(0,2.5,5.0,10.0,15.0μg/m L)处理BV2细胞24h后,采用蛋白免疫印迹法测定各组中TLR4,My D88,NF-κB p65及其磷酸化蛋白的表达水平。设立对照组,BAY11-7082(2μM)抑制剂组,LPS(200ng/m L)处理组,LPS(200ng/m L)+BAY 11-7082(2μM)组,纳米ZnO颗粒处理组(15μg/m L),纳米ZnO颗粒(15μg/m L)+BAY 11-7082(2μM)组,LPS(200ng/m L)+纳米ZnO颗粒(15μg/m L)组,LPS(200ng/m L)+BAY 11-7082(2μM)+纳米ZnO颗粒(15μg/m L)组,采用ELISA方法测定各组细胞培养上清的IL-1β和IL-18水平,蛋白免疫印迹法测定各组中NF-κB p65及其磷酸化蛋白、NLRP3、pro-caspase-1和ASC的蛋白表达水平。4.纳米ZnO颗粒(0,2.5,5.0,10.0,15.0μg/m L)处理BV2细胞24h后,采用Lyso-Tracker Red溶酶体染色标记溶酶体,通过荧光显微镜观察染色结果;采用蛋白免疫印迹法测定各组中LAMP1和LAMP2蛋白表达水平;采用蛋白免疫印迹法测定各组中Cathepsin B蛋白表达水平。设立对照组,CA-074 Me(15μM)抑制剂组,纳米ZnO颗粒处理组(15μg/m L),纳米ZnO颗粒(15μg/m L)+CA-074 Me(15μM)组,采用ELISA法测定各组中细胞上清中的IL-1β和IL-18水平;采用蛋白免疫印迹法测定各组中caspase-1蛋白表达水平。研究结果:1.TEM法图像显示纳米ZnO颗粒的分散性较好;纳米ZnO颗粒的平均水合粒径为(178.13±11.23)nm,Zeta电位为(-8.23±2.12)m V,多分散系数为0.37±0.08。2.(1)纳米ZnO颗粒浓度为15.0,20.0μg/m L时,细胞存活率下降明显,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞存活率随着纳米ZnO颗粒浓度的增高而下降(r=-0.814,P<0.05)。(2)纳米ZnO颗粒浓度为5.0,10.0和15.0μg/m L时,细胞培养上清LDH活性显著升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞培养上清LDH活性随纳米ZnO颗粒浓度的增高而上升(r=0.962,P<0.05)。(3)纳米ZnO颗粒浓度为2.5,5.0,10.0,15.0μg/m L时,细胞培养上清中IL-1β和IL-18水平升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞培养上清中IL-1β和IL-18水平与纳米ZnO颗粒浓度有明显的剂量-效应关系(r IL-1β=0.919,P<0.05;r IL-18=0.994,P<0.05)。(4)纳米ZnO颗粒浓度为5.0,10.0和15.0μg/m L时,NLRP3和caspase-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),纳米ZnO颗粒浓度为10.0和15.0μg/m L时,ASC和pro-caspase-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。且NLRP3,pro-caspase-1,ASC和caspase-1蛋白表达水平随纳米ZnO颗粒浓度的增高而上升(r NLRP3=0.897,P<0.05;rpro-caspase-1=0.767,P<0.05;r ASC=0.751,P<0.05;rcaspase-1=0.885,P<0.05)。3.(1)纳米ZnO颗粒浓度为10.0和15.0μg/m L时,NF-κB p65磷酸化蛋白和TLR4蛋白表达水平显著升高(P<0.05);纳米ZnO颗粒浓度为2.5,5.0,10.0和15.0μg/m L时,My D88蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。且TLR4,My D88和NF-κB p65磷酸化蛋白表达水平随纳米ZnO颗粒浓度的增高而上升(r TLR4=0.798,P<0.05;r My D88=0.826,P<0.05;rpp65=0.758,P<0.05)。(2)经抑制剂BAY 11-7082预处理后,细胞培养上清中IL-1β和IL-18的水平,以及NF-κB p65磷酸化蛋白,NLRP3,ASC和pro-caspase-1蛋白表达水平,均有所下降。与纳米ZnO颗粒处理组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。4.(1)纳米ZnO颗粒浓度增加,荧光探针标记的活细胞溶酶体数量减少,荧光强度降低。(2)纳米ZnO颗粒浓度为5.0,10.0和15.0μg/m L时,LAMP1蛋白表达显著减少;纳米ZnO颗粒浓度为15.0μg/m L时,LAMP2蛋白表达显著减少,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。LAMP1和LAMP2蛋白表达水平随纳米ZnO颗粒浓度的增高而下降(r LAMP1=-0.943,P<0.05;r LAMP2=-0.791,P<0.05)。(3)纳米ZnO颗粒浓度为10.0和15.0μg/m L时,Cathepsin B蛋白表达显著减少,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Cathepsin B蛋白表达水平随纳米ZnO颗粒浓度的增高而上升(r Cathepsin B=0.801,P<0.05)。(4)经抑制剂CA-074 Me预处理后,细胞培养上清中IL-1β和IL-18的水平,以及caspase-1蛋白表达水平均降低。与纳米ZnO颗粒处理组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1.纳米ZnO颗粒导致BV2细胞活力下降,LDH释放增多,炎性因子IL-1β和IL-18分泌增加,且纳米ZnO颗粒激活NLRP3炎症小体。2.纳米ZnO颗粒激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路,并通过该通路影响NLRP3炎症小体激活。3.纳米ZnO颗粒诱导BV2细胞溶酶体损伤并释放Cathepsin B,并通过Cathepsin B的释放影响NLRP3炎症小体的激活。