重金属胁迫条件下野外构树叶片类黄酮含量性别分化及关键基因筛选

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为适应恶劣生态环境,植物会产生大量的类黄酮等代谢产物参与生态防御。雌雄异株植物在多种环境条件下存在性别差异响应。构树(Broussonetia papyrifera)为典型的雌雄异株植物,具有分布广泛、适应能力强、次生代谢物含量丰富等特点,是重金属修复区的先锋树种。全基因组测序结果表明类黄酮合成基因扩张是构树进化过程中的重要事件。在野外环境中,构树是否存在性别分化?参与构树叶片类黄酮合成的关键基因有哪些?构树类黄酮合成基因与重金属胁迫响应基因是否存在耦合?上述这些问题当前均无系统研究。本研究对具有锰、镉、铅、锌等金属复合污染的胁迫环境(湘潭,XT)与满足植物正常生长条件的非胁迫环境(长沙,CS)构树种群性比结构进行实地调查,测定两种环境下构树叶片雌株与雄株在不同发育时期(开花期、结果期与落叶期)的总黄酮、总酚、总蛋白、矿物质含量和叶片的抗氧化性,旨在揭示不同性别构树应对胁迫环境的差异及不同性别构树叶片总黄酮含量变化特征。为确定类黄酮合成的关键基因,从性别差异角度出发,以非胁迫环境构树叶片为研究材料,分别采集构树开花期、结果期和落叶期叶片,利用转录组与代谢组技术,筛选出不同性别构树叶片发生差异表达的关键基因和关键代谢物。通过差异基因和差异代谢物的相关分析,确定构树叶片中类黄酮合成的关键基因,探究不同性别构树叶片在转录和代谢水平的表达调控模式和机制。结合构树叶片抗性基因筛选的转录组数据,采用RobustRankAggreg(RRA)方法,筛选类黄酮合成的关键基因与构树抗性基因之间的共享基因,为环境因子与类黄酮合成调控的内部分子机制提供证明。主要结果如下:(1)通过对两种生境构树开展实地调查,胁迫环境构树性比为1.5~2.27,存在明显的性比偏倚现象,且偏向雄株(p<0.05)。对比两种环境不同性别构树叶片开花期、结果期与落叶期总黄酮含量,总黄酮含量随着构树叶片发育时间逐渐积累,雌株叶片总黄酮含量高于雄株(p<0.05)。胁迫环境构树叶片总黄酮含量高于非胁迫环境(p<0.05)。(2)利用转录组与代谢组技术,筛选出不同性别构树叶片发生差异表达的关键基因和关键代谢物。利用类黄酮代谢组学方法对构树叶片进行分析,鉴定了192个类黄酮代谢物,雌株与雄株相比,开花期、结果期、落叶期分别有72%、55.1%、77.7%差异代谢物下调,即雌株中多数类黄酮物质含量高于雄株。雌雄植株中黄酮类化合物的组成相似,开花后新积累了 16种黄酮类化合物。对差异基因进行功能注释,用KOG数据库对不同性别构树叶片转录组的差异表达基因进行基因功能分类,较多的差异基因注释到次生代谢物的生物合成、运输和代谢分组中;KEGG通路分析表明在三个发育阶段雌株与雄株叶片差异基因均在类黄酮生物合成通路上显著富集,说明在不同性别构树叶片发生的差异基因表达与类黄酮生物合成关系密切。(3)通过差异基因和差异代谢物的相关分析,发现了4个参与类黄酮积累的关键结构基因(CHS2、CHS7、CHI和DFR)。它们大多是类黄酮生物合成途径的上游基因,这些基因的过度表达增加了类黄酮的积累。此外,还发现8种转录因子(TFs),包含2个HSFs家族转录因子(HSFs1,HSFs2),2个MYB家族转录因子(MYB1,MYB2),1个AP2家族转录因子(AP2)、1个NFYA/HAP2家族转录因子(NFYA-H4P2)、2个WRKY家族转录因子(WRKY33a、WRKY33b),这些转录因子通过激活或抑制构树叶片中多个结构基因的表达来调节类黄酮的生物合成。(4)通过构建非胁迫环境与胁迫环境构树叶片基因数据集,对两个数据集里类黄酮合成途径基因表达量进行归一化处理,分别含16个和20个与类黄酮生物合成相关的基因,其中共有基因9个。采用RRA方法探究构树叶片类黄酮合成与重金属胁迫响应的耦合关系,表明CHS、DFR、BZ1是构树叶片类黄酮合成与抗重金属的共享基因。本研究表明了在金属胁迫下,构树叶片参与植物防御机制的类黄酮的积累增强,且存在性别差异响应;明确了构树叶片中类黄酮合成的关键基因,且重金属胁迫会影响构树叶片参与植物防御机制的类黄酮合成基因的表达。本研究对正确认识构树对重金属胁迫的生态机制具有积极意义,并为利用构树在重金属污染地的恢复实践提供理论依据。
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