猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原,为一种有囊膜的单股正链RNA病毒,是冠状病毒科α冠状病毒属的成员。该病主要发生于寒潮季节,感染仔猪会因水样腹泻,呕吐,脱水,及电解质紊乱而死亡。其发病的严重程度及死亡率与猪的日龄呈负相关。特别对于7日龄内的新生仔猪,在缺乏有效母源抗体下,死亡率可高达100%。基于近年流行野毒株的出现及大流行,传统商品疫苗已经对当前流行野毒株缺乏产生充分的抵抗作用。高死亡率使养猪业经济损失惨重。对本实验室分离的猪流行性腹泻流行毒株ZH02进行细胞传代,目前该毒株已在Vero上传代培养至200代,并对其进行了基因组全长测序。在PEDV基因组中核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)由441个氨基酸组成,分子量大小约为55 kDa~58 kDa。N蛋白具有高度的保守性,参与病毒的复制。研究表明,N蛋白具的抗原性较强,可诱导宿主T细胞、B细胞的免疫反应,在PEDV感染的早期,体内就能产生高水平的抗N蛋白抗体,因此N蛋白可作为早期快速检测PEDV感染的一个关键指标。本研究将重组表达载体pET-N转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中,确定最佳诱导表达条件为:37℃250 r/min振荡培养至OD600约为0.6,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃诱导5.5 h。对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,大小为58 kDa,重组蛋白为理论设计蛋白。大量诱导表达后纯化脱盐蛋白的浓度为0.398mg/ml,采用MS/MS质谱鉴定,为制备猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体提供基础。以获得的N蛋白为抗原制备单克隆抗体。用纯化脱盐后的N蛋白经与弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂乳化后,按间隔14 d的免疫程序进行免疫,300μg/只,三免后采血。使用条件建立好的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体效价。选择血清抗体效价最高的BALB/c小鼠加强免疫,3 d后取加强免疫后小鼠脾细胞与SP2/0进行细胞融合。用HAT培养基对杂交瘤细胞进行培养,第5天半换液,第10 d取所有细胞孔上清液进行间接ELISA检测。采用有限稀释法对阳性孔细胞进行亚克隆,重复3次~5次,直至筛选出稳定分泌特异性单抗的单个细胞株。目前已经得到40株单克隆细胞株,进入扩大培养阶段。