研究背景与目的:人类和大鼠的前列腺,均接受两种自主神经纤维的支配,即来自腹下神经与盆神经的交感神经与副交感神经,分布于前列腺的间质平滑肌和腺上皮。绝大多数交感神经的节后纤维为肾上腺素能神经,副交感神经节后纤维为胆碱能神经,一般认为前列腺的间质平滑肌主要接受肾上腺素能神经支配,而上皮组织主要接受胆碱能神经支配。交感神经纤维末梢分泌神经递质为去甲肾上腺素,对前列腺间质细胞的分化及血管、平滑肌的收缩具有重要作用。前列腺内的副交感神经刺激腺泡的分泌,而交感神经则促使前列腺液排入尿道内。交感神经和副交感神经调节正常前列腺的发育和生长。当机体受到各种强烈刺激,如缺氧、创伤、手术、饥饿、疼痛、寒冷及精神紧张和焦虑不安等,机体就会出现以交感神经系统(SNS)兴奋,儿茶酚胺分泌增多和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)分泌增多为主的一系列神经内分泌反应,以适应强烈的刺激,提高机体抗病的能力。一般将能引起促肾上腺皮质激素与糖皮质激素分泌增加的各种刺激,称为应激刺激,由应激刺激引起的机体反应称为应激反应。在这一反应中,除了促肾上腺皮质激素、糖皮质激素分泌增加外,儿茶酚胺分泌也增加。前列腺炎是男性泌尿生殖系统常见疾病,其中慢性前列腺炎(CP)/慢性骨盆疼痛综合症(CPPS)虽占前列腺炎的90-95%,但病因不明。虽然心理应激被认为是其中的致病因素,但潜在的机制没有被具体的阐明。Gatenbeck L等报道短期的标准化的应激刺激能够诱导出大鼠前列腺的无菌性炎症和血流灌注的减少,并同时也在实验中测得儿茶酚胺的增高,认为这种炎症的发生可能是血流减少的结果,但对长期的应激刺激对前列腺的作用没有进行研究。Rosenzweig等在试验中给大鼠每日注射肾上腺素类神经递质苯肾上腺素后,短期内能够诱导大鼠前列腺的炎性病变,并在第7天观察到前列腺内上皮瘤样增生。这些都提示了交感神经在前列腺疾病中起着重要的作用。尽管前列腺增生的发生一直被认为是老龄和雄激素功能存在的结果,对前列腺增生病因的认识仍不清楚。对高血压人群的良性前列腺增生(BPH)发病率的调查结果以及在遗传性高血压大鼠中观察到自发性前列腺组织增生病变均提示前列腺病变与高血压之间有着相关性,而高血压的发生正是和交感神经末梢神经递质的过量释放密切相关。最近的资料显示在BPH患者中,标准化实验应激引起的交感神经过度活动与前列腺增生疾病的主、客观的评价参数相关,表明应激状态和前列腺疾病的发生和进展之间有着某种相关性。最近越来越多的研究重视代谢综合征和它的主要内分泌紊乱—高胰岛素血症在前列腺增生发病中的作用,代谢综合征和高胰岛血症的患者在应激负荷时有着高的SNS和HPA轴的反应性,而短期或长期的应激均能引起血胰岛素水平的增高。越来越多的数据显示交感神经活性增高也可能是前列腺增生及伴随的下尿路症状(LUTS)产生的独立的致病因素。去除交感神经能够引起大鼠前列腺腹侧叶重量、DNA及蛋白含量的减少。交感神经的功能异常对前列腺有促有丝分裂的作用。临床应用α受体阻滞剂可以通过恢复自主神经的平衡,并直接作用于前列腺,影响其生长和增大。大鼠的盆神经节接受两种不同的神经输入,其节后神经支配盆腔脏器,即腹下神经(交感神经)和盆神经(副交感神经)。腹下神经和盆神经的纤维广泛分布到前列腺,调节前列腺的生长、发育和功能。Gosling于1983年通过组织化学染色的方法发现,胆碱能的神经纤维支配上皮细胞、包膜,以及间质的一些平滑肌细胞,而肾上腺素能神经主要支配包膜和间质的平滑肌细胞。两种不同神经在前列腺发挥不同的功能,Wang和Bruschini等研究发现拟交感神经药通过收缩平滑肌促使前列腺分泌,而拟副交感神经药通过刺激上皮细胞分泌的某种机制引起前列腺液的产生。由此从功能上判断得到的结论便是:交感神经主要支配间质,副交感神经支配上皮。同其他实验动物盆神经丛有许多散在分布且相互间联系的盆神经节组成不同,大鼠的盆神经节有单一的主要的神经节(Maj,P.G)组成,且接受独立的交感和副交感神经的输入,这就为研究交感神经对前列腺的影响提供了理想的模型。大鼠的前列腺间质的血管和平滑肌表达多种α受体,接受交感神经的支配,调节间质的生长、发育及血管平滑肌收缩,并通过间质—上皮细胞间的相互作用调节腺上皮的生长和分化,间质—上皮相互作用同样在前列腺增生发病中发挥作用。我们推测应激可以通过交感神经的过度活动,进而影响前列腺的功能,导致疾病的产生,阻断交感神经将抑制前列腺疾病的发生。本研究应用束缚浸水实验制造大鼠心理应激模型,观察慢性应激及阻断交感神经对大鼠前列腺的影响,包括血流、重量、前列腺液分泌、组织病理及神经生长因子(NGF)表达的改变,探讨交感神经系统在前列腺疾病中发挥的作用。材料与方法3月龄SPF级雄性wistar大鼠购于山东大学、山东中医药大学实验动物中心,共32只,每4只一笼。大鼠饲养于山东大学实验动物中心,将大鼠置于昼夜节律光照条件下,自由进食进水,室温在18-22℃,饲养一周以适应环境,每日触摸1次,每次约2分钟,使动物适应实验人员的操作。1.应激方法:大鼠束缚浸水实验:动物随机分成四组:A、正常对照组,B、应激组,C、去交感神经组,D、应激+去交感神经组,每组8只。应激过程:B、D组大鼠每日行束缚浸水1小时,连续14天。对照组不接受任何刺激,自由摄食饮水。大鼠在束缚实验期间禁水、禁食。束缚浸水实验:把实验大鼠用传统方法束缚后放置在23℃温水中,水面和大鼠剑突平齐。2.化学性去交感神经:B、D组于应激第1、8天给予六羟多巴胺50mg/kg尾静脉注射。3.麻醉方法:10%水合氯醛,每0.3ml对应100g大鼠,腹腔注射。4.观测指标:(1)前列腺腹侧叶血流测定应用Periflux system 5000多普勒超声测定大鼠腹侧叶血流灌注情况。每只大鼠经麻醉后,仰卧,下腹部切口。仔细暴露前列腺的腹侧叶,将探针头轻轻放在上面。静止的放置30s以稳定测量血流值并记录。随机选取器官表面3点测量,获得均值。同法测定肾脏的血流。(2)采血测定血皮质醇、肾上腺素及去甲肾上腺素水平动物处死前,使用预冷注射器从大鼠颈静脉采血7ml,加入预先干燥的肝素管,-4℃3000r/min低温离心15分钟分离血浆。吸取血浆加入预冷试管中储存于-30℃,30d内应用高效液相色谱法测定血儿茶酚胺水平,放免法测定皮质醇浓度。(3)前列腺标本处理:每组中6只大鼠:暴露前列腺叶,右侧的腹侧叶(VP)、侧叶(LP)、背侧叶(DP)被分离,每2只大鼠右侧前列腺的相同叶放在一起(每叶有3个集合的标本)用来提取分泌物。解剖左侧的VP、LP、DP,并固定于10%的福尔马林中预备组织学检查。另2只大鼠:每只取成对的VP、LP、DP,称重,用来准备分泌物。分泌物的提取是将分离的前列腺叶用镊子撕开,在50ml的聚丙烯离心管内不锈钢的滤网上低速离心:150g×3min 4℃。移走带有组织的滤网,离心管中收集的液体再次离心:960g×10min 4℃以去除细胞。收集上清,称容,并做为前列腺分泌物冷冻于粉状干冰中。滤网上的组织称重并冷冻于-70℃。(4)前列腺组织学大鼠左侧前列腺三侧叶均切片,切片厚度4μm,每个标本连续切片2片,1片行苏木素—伊红染色,1片做NGF免疫组化染色。Olympus BX51倒置荧光显微镜观察组织切片,Olympus DP71图象采集系统在相同光透量情况下采集图像。对每个标本HE染色切片进行病理学检查(由病理科医生协助完成),应用美国Image Pro-Plus图像分析系统对组化切片进行图像分析,测得每个切片阳性细胞的平均光密度值。5.统计方法统计方法以双因素析因设计资料的方差分析检验组间差异显著性,统计处理软件为SPSS13.0,实验数据计算平均值和标准差(X±SD),P＜0.05认为差异有显著性意义。结果一、慢性应激对大鼠前列腺腹侧叶血流灌注的影响1.同对照组相比,慢性应激使腹侧叶前列腺和肾脏的血流灌注量分别减少了大约15%(P＜0.05)和18%,对两者血流比值无明显影响。2.同对照组相比,去除外周交感神经组大鼠前列腺血流增加了1倍(P＜0.01),应激并去除交感神经组大鼠前列腺血流增加了1.4倍(P＜0.05)。两组前列腺血流均比单纯应激组明显增高(P＜0.05),前列腺/肾脏血流比值较对照组及单纯应激组明显增高(P＜0.05)。二、慢性应激对大鼠前列腺各叶重量及分泌的影响1.与对照组相比,慢性应激组大鼠前列腺腹侧叶重量显著降低(P＜0.01),应激并去除交感神经组腹侧叶重量亦降低(P＜0.05),两组前列腺液分泌量均降低(P＜0.05)。2.去除交感神经组大鼠前列腺腹侧叶重量降低(P＜0.01),前列腺分泌同对照组无明显差异。3.慢性应激组及去神经组大鼠侧叶重量增加(P＜0.05),前列腺液分泌量同对照组相比无明显差异。4.去除交感神经组背侧叶重量及前列腺液分泌均明显增加(P＜0.05)。三、慢性应激对大鼠血浆皮质醇和儿茶酚胺(肾上腺素及去甲肾上腺素)水平的影响1.慢性应激组及去神经组大鼠血浆皮质醇浓度较对照组明显增加(P＜0.05),去神经后应激较单纯应激组皮质醇水平下降。2.慢性应激及去除交感神经后大鼠血肾上腺素水平较对照组均降低(P＜0.05),两者间存在协同作用(P＜0.05)。3.各组中血去甲肾上腺素水平无明显差异。四、慢性应激对大鼠前列腺组织学的影响1.对照组大鼠,每叶的前列腺腺泡呈圆形或椭圆形,由单层的高柱状上皮组成。慢性应激组腹侧叶上皮呈增生性改变,表现为上皮向腺泡内绒毛样生长、小结形成、细胞重叠成多层和极性的丧失,腺泡形态呈波形;而侧叶、背侧叶几乎未受影响。2.化学性去除交感神经导致前列腺腺泡的扩张。3.应激并去神经组大鼠,腹侧叶腺泡可见扩张,没有观察到上皮增生的改变。所有三叶均可见上皮的萎缩和发育不良。五、慢性应激对神经生长因子表达的影响1.对照组大鼠前列腺上皮胞浆内可见神经生长因子的表达,间质未见明显NGF的表达。2.慢性应激后腹侧叶腺上皮神经生长因子表达增高(P＜0.01),侧叶表达减少(P＜0.05),背侧叶无明显变化。3.去除神经后腹侧叶(P＜0.01)及侧叶神经生长因子表达均明显减少(P＜0.05),背侧叶无明显变化。4.去神经后应激组腹侧叶及侧叶NGF表达较单纯去神经组高,去神经及应激两者间存在交互作用(P＜0.05)。结论1.慢性应激能够引起大鼠腹侧前列腺叶血流灌注、重量及前列腺液分泌量的减少,血浆皮质醇升高。2.慢性应激可以使大鼠前列腺腹侧叶上皮呈增生样改变,而侧叶、背侧叶基本不受影响。3.去除交感神经导致前列腺腺泡的扩张,同时给予应激时腹侧叶上皮未见增生改变。交感神经的过度活动参与前列腺疾病的发病。4.神经生长因子表达于大鼠前列腺上皮细胞,应激后腹侧叶NGF表达升高,去神经后可见显著降低,NGF水平变化参与应激及去神经引起的增生和萎缩改变。