论文部分内容阅读
促血管生成素(Ang)是一种血管生成调节因子,已被证实能够参与调节生理和病理性血管生成过程。内皮细胞中的Ang/Tie信号通路在胚胎期血管形成、成熟,维持成熟血管稳定发挥重要作用。洛克沙肿(Rox)作为有机砷饲料添加剂被广泛运用,能够促进内皮细胞生长,但可能存在着潜在的致癌风险。本实验室已从体内体外对洛克沙胂的促血管作用进行了相关研究。本文在洛克沙胂对大鼠内皮细胞的生长中,通过阻断Ang-2和Tie-2,利用MTT实验、免疫荧光分析、Elisa、Western blot和荧光定量PCR方法,研究在Rox促内皮细胞生长中Ang/Tie系统发挥的作用。大鼠内皮细胞体外实验中,不同药物处理分组如下：3个Rox浓度组(0.10μM,1.00μM,10.00μM)；4个阻断剂组：50ng/mL Ang-2阻断剂(Anti-A),50ng/mL Tie-2阻断剂(Anti-T),1.00μM Rox+50ng/mL Ang-2阻断剂(1+Anti-A),1.00μM Rox+50ng/mL Tie-2阻断剂(1+Anti-T); PBS阴性对照,10ng/mL VEGF阳性对照。药物处理24h或者48h后,MTT法检测细胞活力,免疫荧光分析Ang-2和Tie-2的表达分布,Elisa法检测细胞上清中Ang-2水平,Western Blot检测内皮细胞内Ang-2和Tie-2的表达,RT-PCR检测内皮细胞中Ang-2和Tie-2基因的转录水平。MTT法检测内皮细胞处理24h的细胞活力显示：0.10μM～10.00μM的Rox组OD值显著高于PBS组(P<0.05),1.00μM组OD值最高。1+Anti-A组、1+Anti-T组OD值显著低于1.00μM组(P<0.05)。内皮细胞处理48h的结果与24h相似。说明Ang-2及其受体Tie-2可能与Rox促内皮细胞生长有关。细胞爬片免疫荧光分析表明Ang-2主要分布在细胞质中,Tie-2主要表达在细胞膜上。Elisa实验检测内皮细胞培养液中的Ang-2含量。结果显示1.00μM和10.00μM Rox组Ang-2水平都显著高于PBS组(P<0.05),0.10μM组高于PBS组但差异不显著(P>0.05)。Rox1.00μM组的Ang-2水平最高。阻断Tie-2后,Ang-2水平显著升高(P<0.05)。结果表明Rox可促进内皮细胞Ang-2的分泌,1.00μM的Rox促分泌作用最强,Tie-2阻断与否与Ang-2分泌水平有关。Western Blot实验对内皮细胞中的Ang-2和Tie-2蛋白分析表明,VEGF组、0.10μM、1.00μM、10.00μM Rox和Anti-T组与PBS组比较Ang-2的表达量显著升高(P<0.05),1+Anti-A组的Ang-2表达量显著低于1.00μM Rox组(P<0.05)。而VEGF组、0.10μM～10.00μM Rox组的Tie-2表达量均高于PBS组,差异显著(P<0.05),1+Anti-A组和1+Anti-T组的Tie-2表达量显著低于1.00μM组(P<0.05)。洛克沙胂浓度为1.00gM时,Ang-2和Tie-2的表达量最高。结果表明洛克沙胂能促进内皮细胞中的Ang-2和Tie-2的表达,且从蛋白水平表明Ang-2/Tie-2在洛克沙胂促内皮细胞生长中发挥作用。荧光定量PCR检测中,与PBS组比较,VEGF组和1.00μM Rox组Ang-2基因转录水平显著升高(P<0.05)。0.10μM组和10.00μM组比PBS组高,但差异不显著。Anti-T组比PBS组显著升高(P<0.05),1+Anti-T组比Rox1.00μM组显著升高(P<0.05). Tie-2PCR数据表明：VEGF组、3个Rox处理组、Anti-A组和Anti-T组都比PBS组显著升高(P<0.05)。Rox在1.00μM时Tie-2基因转录水平最高。1+Anti-A组和1+Anti-T显著低于1.00μM。Rox能显著提高Ang-2和Tie-2的mRNA转录水平,从mRNA水平说明Ang-2/Tie-2在洛克沙胂促内皮细胞生长中发挥作用。综上所述,洛克沙胂在0.10μM～10.00μM范围能促进内皮细胞增殖,提高Ang-2和Tie-2的表达,且Ang-2/Tie-2信号在Rox促内皮细胞生长中发挥重要作用。