茯砖茶上的关键真菌-冠突曲霉（Aspergillus cristatus）,在实验条件下,当在MYA固体培养基中加入少量氯化钠时该菌容易产生有性形,当在MYA中加入较高浓度的氯化钠时,该菌容易产生无性型。所以冠突曲霉可以作为研究丝状真菌有性型和无性型发生分子机制的良好材料。在丝状真菌模式生物构巢曲霉中,其无性发育受到中心调控路径中brl A、aba A、wet A,中心调控路径修饰基因StuA以及中心调控路径激活因子Flu G、Flb A-E的调控。FlbD是一种上游发育激活因子,对无性发育有调控作用,有研究报道,StuA基因在影响无性发育的同时,也参与了有性发育的调控。本研究以冠突曲霉为实验材料,以FlbD和StuA基因为切入点,采用根癌农杆菌介导的同源重组法和基因过表达技术对FlbD和StuA基因进行功能研究,对丝状真菌的产孢分子机制研究具有借鉴意义。主要结论如下:1.FlbD基因全长951bp,无内含子序列,编码316个氨基酸,保守结构域为SANT和Myb＿DNA-bind＿6,无跨膜结构,含有PLN03212﹑REB1超家族蛋白。2.StuA基因全长1933bp,编码610个氨基酸,编码蛋白无跨膜结构。该基因含有2个内含子,大小分别为50 bp、50 bp,分别位于StuA基因262-313bp、507-558bp处,含有Kil A-N保守结构域,位于StuA基因序列的557-724bp处;PHA03247超家族蛋白,位于StuA基因序列的854-1636bp处。3.通过构建基因敲除载体,利用根癌农杆菌介导的同源重组法获得FlbD基因敲除菌株,通过RT-qPCR检测FlbD基因敲除株的外源基因HYG的拷贝数为单拷贝。对ΔFlbD和野生型冠突曲霉进行观察发现:与野生型相比,突变株的分生孢子数量较野生型的下调4.7倍,差异显著,而子囊孢子数量相差不大;在添加不同浓度的氯化钠培养基上:ΔFlbD突变株的生长速率与野生型的没有明显差异,但是突变株会产生大量“棉花”状的气生菌丝,菌落边缘的菌丝较稀疏;在3M氯化钠培养基上培养3天,ΔFlbD突变株分生孢子的产生有延缓现象,并且分生孢子的产生主要集中在菌落中心。4.将冠突曲霉中的FlbD基因过表达后,菌株会产生大量的分生孢子,在2mol/L NaCl的MYA培养基上其数量较野生型上调4.2倍;在3 mol/L NaCl条件下其数量较野生型上调3.5倍。5.成功获得StuA基因敲除菌株,通过RT-qPCR检测StuA基因敲除株的外源基因HYG的拷贝数为单拷贝。通过对ΔStuA和野生型冠突曲霉进行观察发现:与野生型相比,突变株不会产生闭囊壳和分生孢子,差异显著;在添加不同浓度的氯化钠培养基上:ΔStuA突变株的菌落直径比野生型的小,且菌落呈褐黄色,有大量黑褐色渗出液产生;6.将冠突曲霉中的StuA基因过表达后,菌落中心产生大量的分生孢子,在2mol/L NaCl的MYA培养基上其数量较野生型上调1.7倍;在3 mol/L NaCl条件下其数量较野生型上调1.8倍;过表达菌株在0 mol/L NaCl的MYA培养基上,菌落有褶皱现象并产生少量黑褐色渗出液。