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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)以生物制剂或转基因植物的形式被广泛运用于农业和卫生害虫的生物防治,其在带来巨大经济和社会效益的同时,也存在着生态安全隐患,因此转Bt基因产品的检测监控技术是其产品安全管理、市场监管和风险评估的技术基础和必要保障。目前检测技术正随着基因工程抗体的不断发展而改革创新。新型抗体-十二肽和单链抗体(single-chain antibody fragment,scFvs)已逐渐应用于免疫学检测领域。十二肽是将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pⅢ)上,所展示的十二肽表达在pⅢ的N末端,目前主要应用于模拟抗原表位;单链抗体(ScFv)是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由氨基酸Linker拼接而成,分子量约为30 kD。这些新型抗体可以保持与抗原结合的特异性并且无需免疫手段,通过原核表达大量制备。噬菌体展示技术正是筛选、制备和表达单链抗体的一种最有效方式,而且也是获得抗独特型抗体的一种新的制备方式。利用噬菌体展示技术将抗体的基因型和表现型相结合的独特优势,为进一步开展亲和力成熟及蛋白结合机制等研究提供了基础。以此为基础,本文开展了以下二个方面的内容:1.建立基于十二肽检测Cy2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法利用噬菌体展示随机十二肽库对Cry2Aa毒素蛋白进行四轮筛选,并从第4轮产物中随机挑选了 20个克隆,通过单克隆ELISA法鉴定出这些克隆均能与Cry2Aa毒素特异性结合。经过PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV),由此建立了基于十二肽的Cry2Aa 蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1.139μg/mL,最低检测限IC10为0.0211μg/mL,线性检测范围为0.0478～22.691μg/mL(y=23.091gx+48.692,R2=0.9963)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。2.建立基于单链抗体检测Cry2Aa毒蛋白的双抗夹心ELISA检测方法通过优化固相化筛选策略,利用人源化噬菌体抗体库(TomLinson Ⅰ)筛选抗Cry2Aa毒蛋白的单链抗体(SingLe-chain antibodies,scFv)。经4轮"扩增-吸附-洗脱"后,从最后一轮洗脱产物中随机挑取200个单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得12个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。将相相对结合活性最好的阳性隆scFv-A3替换到宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。并利用纯化后的scFv-A3作为"捕获抗体",Anti-Cry2Aa兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry2Aa的双抗夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法的最低检测限为1.08 ng/mL线性检测范围在7.1ng/mL-3.8μg/mL,线性回归方程为y=167.96x+0.4513(R2=0.9909)。3.Cry2Aa毒蛋白的抗独特型单链抗体的筛选以Cry2Aa为免疫原免疫新西兰大白兔得到Cry2Aa的多克隆抗体。再以亲和纯化Cry2Aa多抗和阴性抗体作为包被原,通过扣除筛选(subtractive panning)策略在人源化噬菌体抗体库Tomlinson Ⅰ中,淘选Cry2Aa毒蛋白的抗独特型单链抗体。分别采取两种试验方案:一种是只进行一轮筛选,洗涤次数为40次;另一种是进行四轮筛选,逐级降低包被原,增加洗脱次数,具体方法同抗Cry2Aa单链抗体的筛选方法。两种方法均挑取200个克隆。结果显示:只经过一轮筛选,可获得并鉴定出38个阳性克隆;经过四轮筛选之后获得125个阳性克隆。再通过与受体(小菜蛾的BBMV)结合后,其中B10的OD450为0.806最高,F2为0.584次之,阳性对照1.472,阴性对照0.138,无关克隆反应值0.105。说明B10和F2均与小菜蛾的BBMV有一定的结合活性,确定这2个抗独特型抗体的亚型为Ab2β,为下一步杀虫活性研究提供了初步基础。