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生物污损在世界范围内造成了巨大经济损失且治理困难,严重影响海洋运输、海岸工程等生产活动。海洋微藻、细菌等微生物形成的生物膜,是海洋大型污损生物附着的基础,而硅藻是海洋可见光照射范围内形成生物膜的主要生物,因此防止硅藻附着是缓解大型污损生物附着状况的重要途径。硅藻分泌的胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)是影响硅藻生物膜形成的重要物质,可以分为溶解性EPS(Soluble EPS,SL-EPS)和粘附性EPS(Bound EPS,B-EPS),对于硅藻附着具有重要作用。本文通过对硅藻双眉藻(Amphora sp.)EPS的分析,研究EPS与硅藻细胞附着之间的关系。研究结果如下:1.本文筛选得SL-EPS和B-EPS最适提取方法分别为高速离心法和福尔马林-NaOH法。利用SL-EPS易溶于水的特点,本文采用高速离心法对SL-EPS进行提取。从对B-EPS提取效率较高的四种方法:水浴加热法(30℃、70℃)、福尔马林-NaOH法、阳离子交换树脂法中进行B-EPS方法筛选。分析发现,提取方法差异对提取得到B-EPS各物质含量有重要影响。不同提取方法对于DNA浓度影响最大,对蛋白质、总糖、糖醛酸浓度影响较小,硫酸基浓度变化最小。通过对比不同方法对B-EPS各物质和EPS总量的影响,发现30℃水浴法提取效率低;70℃水浴法会导致蛋白质、多糖等物质水解变性,进而影响EPS的后续分析;阳离子交换树脂法获得B-EPS各物质浓度较高,但造成藻细胞大量破裂;福尔马林-NaOH法在没有造成细胞破裂的前提下,获得EPS总量最大,且获得总糖、糖醛酸的浓度最高。因此本文选择福尔马林-NaOH处理法作为提取双眉藻(Amphora sp.)B-EPS的方法。2.磷浓度变化对于细胞生长、胞内物质、胞外物质有不同程度影响。磷元素是限制藻类生长、繁殖和生物膜形成的重要因素,而硅藻EPS与生物污损中的生物膜形成关系密切,因此本文研究磷元素对硅藻(Amphora sp.)EPS组成、含量的影响。实验调整f/2培养基中磷浓度至标准浓度的1/4P、1/2P、1P、3/2P、2P,进行硅藻培养。随着培养基磷浓度增加,单个细胞胞内物质(蛋白质、多糖、硫酸基、脂肪)的浓度均降低,但胞内糖醛酸浓度增加。磷浓度的增加,使细胞SL-EPS中多糖、糖醛酸和硫酸基含量降低,但对蛋白质浓度影响较小。同时通过福尔马林-NaOH处理法提取藻细胞的B-EPS,发现磷浓度对B-EPS中各组分比例产生影响。总体表现为,随着磷浓度增加,细胞B-EPS的蛋白质、总糖浓度降低,糖醛酸和硫酸基含量呈现先增加后降低的趋势。对比发现,磷浓度增加对于培养体系中硅藻SL-EPS总产量促进作用有限,最高组SL-EPS总产量与最低组仅相差43.4μg。同时,磷浓度的增加对于培养体系中双眉藻B-EPS的总产量具有促进作用,B-EPS总产量最高组是最低组的1.8倍。SL-EPS与B-EPS存在相互转化的可能,因此将两者的数值结合进行分析。结果表明,随着磷浓度的增加,培养体系产生的EPS总量总体上不断增加,但单个双眉藻(Amphorasp.)细胞EPS总产量不断降低。3.EPS与硅藻附着强度有密切联系,本文采用微流体冲刷法,对不同磷浓度条件下培养获得的双眉藻(Amphora sp.)细胞,进行了细胞附着强度测试。在对实验使用的蠕动泵稳定性测试中,获得泵的转速与水流剪切应力的线性关系方程,其R2达到了 0.998,表明泵的稳定性良好。相同磷浓度条件下,硅藻附着时间会影响细胞附着强度,附着24h的硅藻细胞附着强度高于附着2h组。附着时间统一选择为24 h,测试磷浓度对藻细胞附着强度的影响,结果表明,在本实验测试的磷浓度范围内,磷浓度越高,双眉藻(Amphora sp.)细胞的附着强度越大。具体结果为,1/4P、1P和2P条件下培养获得藻细胞,细胞保留率为 50%时剪切应力τ50 分别为 370.2 dyn/cm2、1165.1 dyn/cm2 和 1345.0 dyn/cm2。4.糖类作为构成EPS的重要物质,研究多糖对讨论硅藻细胞附着具有重要意义。实验通过内标法确定11种单糖标准品出峰时间,确定了各单糖在混合样品HPLC图谱中位置。单糖按出峰顺序依次为:Man、Glc-N、Rha、Glc-A、Gal-A、Glc-Nac、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc。结果表明,SL-EPS中共出现10种单糖,B-EPS中共出现8种单糖。SL-EPS中1/4P组的优势单糖为Glc-Nac(29.01%)和Gal-A(19.90%),1 P组中优势单糖为Glc-A(25.68%)、Gal-A(20.55%)和 Xyl(21.18%);2 P 组中的优势单糖为 Glc-A(35.24%)和 Xyl(26.66%)。B-EPS中1/4 P组中的优势单糖为Gal-A(35.85%)和Xyl(19.91%);1 P组中的优势单糖为 Xyl(27.30%)和 Glc-N(21.65%);2 P 组的优势单糖为 Glc-N(27.46%)和 Xyl(27.47%)。同时,随着磷浓度的增加,SL-EPS和B-EPS中Glc-N、Glc-A和Xyl的摩尔占比在增加。而B-EPS中Rha、Gal-A和Fuc的摩尔占比降低。所以,Glc-N、Glc-A和Xyl的增加及B-EPS中Rha、Gal-A和Fuc的减少,对藻细胞附着强度的增加应有促进作用。综上,本文通过四种B-EPS提取方法对比,筛选出适合双眉藻(Amphora sp.)B-EPS的提取方法——福尔马林-NaOH法。研究了磷浓度对双眉藻(Amphora sp.)胞内物质、SL-EPS和B-EPS的影响。将EPS变化情况与细胞的附着强度联系起来,发现单个细胞总EPS产量与藻细胞附着强度成反比,培养体系中的EPS总量与附着强度成正比。实验发现,随着磷浓度增加,附着强度不断增加,SL-EPS和B-EPS中多糖的Glc-N、Glc-A和Xyl的摩尔占比也增加,而B-EPS中Rha、Gal-A和Fuc的摩尔占比降低。本文认为,培养体系EPS总量的增加,以及上述六种单糖摩尔占比的变化,与藻细胞的附着强度增加有一定关系。