背景与目的:研究表明,人类生命早期应激是多种精神疾病的重要风险因素,可诱发重性抑郁症、创伤后应激障碍、儿童注意缺陷症及精神分裂症等疾病。关于其致病机制的研究,目前主要集中在神经内分泌系统,但由于道德的约束及方法学的限制,以人为对象的研究还是有限的,故为了进一步深入、全面地探讨生命早期应激引起人类精神疾病发病的机制,目前的研究主要采用动物模型。其中,应用于啮齿类动物的母爱剥夺模型,因其符合人类生命早期母子分离的特征,得到了广泛应用,而且关于其影响机制的研究,目前主要集中在下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴反应性增强和海马5-羟色胺(5-HT)系统功能的减低等。本课题组的相关研究也表明,母爱剥夺导致大鼠海马CA1区的5-HT1A受体阳性细胞数量减少。随着神经影像学技术的发展,越来越多的证据表明抑郁症等精神疾病不仅仅是一种单纯的功能性疾病,其发病还伴有海马损伤和齿状回神经元再生障碍等多种神经生物学改变,以及脑部结构改变如海马体积缩小等。基于国内外的研究进展和本课题组以往的实验结果,我们认为,人类生命早期应激是多种精神和躯体疾病的重要风险因素,而多种原因和机制导致的海马损伤、齿状回神经元再生障碍以及海马的形态结构改变,可能是生命早期应激引起精神疾病(尤其是抑郁症)发病的重要神经生物学机制之一。因此,本研究以大鼠母爱剥夺建立人类生命早期应激的动物模型,观察母爱剥夺对大鼠自发活动和学习记忆的影响,并通过对大鼠海马损伤和齿状回神经元再生的研究,探讨该影响的神经生物学机制。同时本研究也为我们进一步深入了解生命早期应激在人类精神疾病的发生、发展过程中的作用提供一定的理论基础,并为幼儿早期教育和心理干预提供理论指导。材料与方法:健康、性成熟清洁级Sprague-Dawley大鼠,体重200-250g,雌雄各1只同笼饲养,待其繁殖,新生雄性大鼠用于实验研究。母爱剥夺模型分为两个阶段:(1)母婴分离阶段:从大鼠出生后第3天至21天,每日母婴分离3小时;(2)隔离饲养阶段:经历过母婴分离的大鼠自第22天断奶后单笼饲养至第60天。分别在每一阶段末(即22日龄和61日龄)实施自发活动试验和Morris水迷宫试验,观察大鼠的自发活动和学习记忆能力。行为学实验结束后将大鼠断头取脑,制作石蜡切片,观察海马及齿状回神经元数量、神经元凋亡和齿状回神经元再生情况。实验数据应用EXCEL 2003和SPSS13.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布的数据应用均数±标准差(x±S)表示,进行两独立样本的t检验;若数据不符合正态分布则应用中位数(四分位数间距)[M(QR)]表示,进行两独立样本的非参数检验。以P<0.05为差别有显著性。结果:母爱剥夺组大鼠于出生后的第3-21天和第22-60天分别接受母婴分离和隔离饲养应激,对照组正常饲养,分别在22和61日龄测定各组大鼠的自发活动和学习记忆能力。行为学实验结束后,处死大鼠取脑,制作石蜡切片,观察海马及齿状回神经元数量和神经元凋亡情况。1.母爱剥夺对大鼠自发活动的影响①22日龄:母爱剥夺组大鼠自发活动总路程和周边路程较对照组显著增多(P<0.05),而中央路程、总活动时间、中央时间和周边时间差别均无统计学意义。结果表明,母婴分离应激导致大鼠自发活动增多,提示母婴分离应激诱发了大鼠的焦虑样行为。②61日龄:母爱剥夺组大鼠自发活动的总活动时间较对照组显著延长(P<0.01),而其他指标差别均无统计学意义。结果表明,大鼠经过母婴分离和隔离饲养双重应激后,自发活动时间延长并活动迟缓,提示大鼠可能同时存在焦虑样和抑郁样行为。2.母爱剥夺对大鼠学习记忆的影响Morris水迷宫试验共进行5天,前4天为定位航行(place navigation)训练,每日2次,主要反映大鼠的空间学习能力,以逃避潜伏期(escape latency,EL)为指标;第5天为空间探索(spatial probe)试验,主要测定大鼠的空间记忆能力,以各象限的游泳时间、平台周边各个区域游泳路径的百分比和穿越原平台的次数为指标。Morris水迷宫试验分别在22日龄和61日龄开始检测。①22日龄:定位航行实验中,母爱剥夺组大鼠在第三天寻找隐匿平台的逃避潜伏期显著延长(P<0.05),综合四天的平均逃避潜伏期,母爱剥夺组大鼠显著地长于对照组(P<0.05);空间探索实验中,母爱剥夺组大鼠在第三象限(目标象限)的游泳时间显著的低于对照组(P<0.05)。结果表明,母爱剥夺组大鼠此阶段的Morris水迷宫成绩明显低于对照组,提示母婴分离损害了大鼠的学习记忆能力。②61日龄:定位航行实验中,母爱剥夺组大鼠在第一、二、三和第四天寻找隐匿平台的逃避潜伏期以及四天平均逃避潜伏期均显著延长(P<0.05或P<0.01);空间探索实验中,母爱剥夺组大鼠在第四象限的游泳时间显著增多(P<0.05);穿越原平台的次数显著减少(P<0.05)。结果表明,大鼠经过母婴分离和隔离饲养双重应激后,依然存在学习记忆障碍。3.母爱剥夺对大鼠海马和齿状回神经元数量的影响行为学实验结束后,分别处死各组大鼠取脑,尼氏染色检测海马及齿状回神经元数量,观察母爱剥夺对其神经元的影响。①22日龄:母爱剥夺组大鼠海马CA2、CA3区锥体细胞和齿状回颗粒细胞数量较对照组显著减少(P<0.01)。结果表明,母婴分离可导致大鼠海马部分区域和齿状回神经元数量的减少,提示海马和齿状回存在损伤。②61日龄:母爱剥夺大鼠CA3区锥体细胞数量较对照组大鼠明显减少(P<0.01)。结果表明,大鼠经受母婴分离应激和隔离饲养双重应激后,仍表现为海马部分区域神经元数量的减少,提示海马依然存在损伤。4.母爱剥夺大鼠海马和齿状回神经元凋亡的影响用TUNEL法检测22和61日龄海马及齿状回神经元凋亡情况。①22日龄:母爱剥夺组大鼠海马CA3区锥体细胞和齿状回颗粒细胞凋亡相对阳性率较对照组显著增多(P<0.05或P<0.01)。结果表明,母婴分离导致大鼠海马CA3区及齿状回神经元凋亡的增加。②61日龄:母爱剥夺大鼠海马CA3区锥体细胞凋亡相对阳性率较对照组显著增多(P<0.05)。结果表明,大鼠经受母婴分离应激和隔离饲养双重应激后,仍表现为海马部分区域神经元凋亡的增加。结论:生命早期母爱剥夺可导致大鼠出现焦虑样样行为或伴有抑郁样行为,并存在空间学习记忆能力的降低,其神经生物学机制之一是母爱剥夺导致了大鼠海马和齿状回神经元数量的减少,而神经元凋亡的增加是导致神经元数量减少的原因之一。