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研究背景:NLRP3炎症小体是由多种蛋白组成的复合体,与多种炎性疾病的发生发展有关,是抗炎药物开发的重要靶标。NLRP3活化后与ASC及Pro-caspase-1形成复合物,引起Pro-caspase-1切割为caspase-1。活化的caspase-1进一步将Pro-IL-1β和Pro-IL-18转变为成熟的IL-1β和IL-18。雷公藤红素（Celastrol）是一种从中药雷公藤（Tripterygium wilfordi Hood.F.）中提取的活性成分。Celastrol已在糖尿病并发症、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎等疾病中显示出良好的抗炎活性,但其抗炎机制目前集中体现在调控NF-κB途径上,Celastrol对NLRP3炎症小体的作用机制并不明确。因此,本课题在多种NLRP3炎症小体活化细胞模型、小鼠免疫性肝损伤及痛风性关节炎模型上评价Celastrol的抗炎作用,并探讨Celastrol抑制NLRP3炎症小体的作用机制,为Celastrol及雷公藤相关中药产品研发及中医临床应用提供一定的实验依据。研究方法与结果:首先,我们在THP-1细胞株、小鼠原代骨髓巨噬细胞（BMDM）中进行LPS（10 ng/mL,3 h）和Nigericin（10μM,1 h）处理,同时在HEK293T细胞上共转NLRP3炎症小体相关质粒并给予Nigericin（10μM,1 h）处理,在以上三种细胞上建立NLRP3炎症小体活化的体外模型评价Celastrol的作用。采用ELISA实验检测细胞上清液IL-1β的水平,结果显示在上述模型中,Celastrol给药均能显著降低IL-1β的水平。采用Western blot实验我们检测了NLRP3炎症小体复合蛋白（NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Pro-IL-β、caspase-1和IL-1β）的表达水平,结果显示Celastrol能明显抑制Pro-caspase-1及Pro-IL-1β分别向caspase-1和IL-1β的转化,对其他蛋白的表达水平无明显影响。我们进一步在HEK293T细胞中共转染NLRP3、ASC、caspase-1、Pro-IL-1β-Gaussia luciferase（iGLuc）质粒并给予Nigericin（10μM,1 h）处理,结果发现Celastrol能显著抑制iGLuc萤光信号。以上实验在体外水平证明了Celastrol对NLRP3炎症小体有显著的抑制作用。其次,我们利用C57BL/6小鼠P.acnes/LPS肝损伤和尿酸钠结晶（MSU）痛风性关节炎两种体内模型研究Celastrol对NLRP3炎症小体的抑制作用。在P.acnes/LPS肝损伤模型中,我们发现Celastrol高低剂量（0.5和0.25 mg/kg,i.p.）能显著抑制P.acnes/LPS诱导的血清ALT和AST水平升高,缓解肝组织病理损伤（HE染色）,并减少TUNEL阳性细胞及巨噬细胞数目。在小鼠MSU痛风性关节炎模型中,我们从关节肿胀和病理损伤的程度评价Celastrol对痛风性关节炎的药理作用。实验结果显示,Celastrol高低剂量（1和0.5 mg/kg）均可缓解MSU引起的关节肿胀,且能明显改善关节组织中炎性细胞浸润（HE染色）。我们进一步在以上两种动物炎症模型中,采用ELISA和Western blot实验检测Celastrol对炎症因子及NLRP3炎症小体相关蛋白的影响。实验结果发现,P.acnes/LPS及MSU均能显著增加小鼠肝组织和关节组织中成熟的IL-1β和活化的caspase-1水平,而高低剂量的Celastrol能降低二者水平。为了确证NLRP3炎症小体在Celastrol抗炎机制中的作用,我们采用NLRP3-/-小鼠建立P.acnes/LPS肝损伤模型。实验结果发现,在NLRP3-/-小鼠中,Celastrol能在一定程度上降低P.acnes/LPS处理后血清中ALT及AST的水平,并减轻病理损伤。然而,与Wild-Type小鼠相比,Celastrol对NLRP3-/-小鼠的抗炎效果明显减弱。以上实验在体内水平证明了Celastrol对NLRP3炎症小体有显著的抑制作用。最后,我们探讨了Celastrol抑制NLRP3炎症小体活化的机制。Confocal实验结果显示,BMDM细胞在未刺激时,ASC和NLRP3分别均匀表达于细胞核及细胞质中,处于弥散状态。LPS/Nigericin处理后,ASC从细胞核中转移至细胞浆中与NLRP3聚集成点状并且发生明显共定位。Celastrol给药（500 nM,1 h）能明显抑制LPS/Nigericin诱发的NLRP3和ASC的聚集以及二者的共定位,提示Celastrol影响了NLRP3与ASC复合体的组装。这一现象在HEK293T炎症小体相关蛋白共表达系统中得以验证。已有文献报道BRCC3介导NLRP3的K63去泛素化在NLRP3炎症小体的活化中起着至关重要的作用,鉴于Celastrol对NLRP3蛋白的表达量无影响,我们推测Celastrol抑制NLRP3的活化与其调控NLRP3的K63去泛素化有关。为了验证这一假说,我们首先在体内及体外模型中进行了Immunoprecipitation（IP）实验。结果显示,在未处理的BMDM和HEK293T细胞与正常小鼠的肝组织及关节组织中,NLRP3蛋白处于K63泛素化状态。与此相比,LPS/Nigericin处理的BMDM及HEK293T细胞、P.acnes/LPS及MSU分别处理的小鼠肝脏和关节组织中的NLRP3发生了K63去泛素化,而Celastrol给药处理后显著抑制了这一变化。Cellular Thermal Shift Assay（CETSA）结果提示Celastrol能与去泛素化E3酶BRCC3结合,有效地保护BRCC3蛋白免受温度依赖性降解。以上实验证明了Celastrol与BRCC3相互作用并抑制BRCC3介导的NLRP3的K63去泛素化,从而影响NLRP3炎症小体的活化。研究结论:（1）用THP-1细胞、HEK293T和BMDM细胞构建NLRP3炎症小体活化模型,体外水平上阐明了Celastrol对NLRP3炎症小体的抑制作用。（2）构建小鼠P.acnes/LPS肝损伤和MSU痛风性关节炎模型,通过体内实验证明Celastrol对NLRP3炎症小体的抑制作用。（3）通过体内外实验研究发现Celastrol抑制BRCC3调控的NLRP3的K63去泛素化,影响了NLRP3炎症小体的活化及NLRP3-ASC复合体的形成。（4）该课题从抑制NLRP3炎症小体的活化角度深层次地解析了Celastrol的抗炎机制,为Celastrol及相关中药产品的开发及临床应用提供必要的实验依据。