弧菌(Vibrio)属革兰氏阴性菌,分布广泛,部分条件致病菌属于食源性致病菌,严重威胁着水产品安全以及人类健康。目前抗菌药物仍然是治疗弧菌性疾病的主要方法,但随着抗菌药物的不合理使用或者大面积使用,造成弧菌对部分药物产生不同程度的耐药性。因此,需要进行水产养殖源弧菌耐药性监测研究,为有效控制弧菌对抗菌药物的耐药性提供理论依据。为了解上海郊区、江苏、福建以及海南四个地区养殖源弧菌的流行情况及抗菌药物的耐药情况,对采集的菌株进行分离鉴定;其次检测养殖对虾源副溶血弧菌对抗菌药物的敏感性,并检测其耐药基因的携带率,旨在了解四个地区养殖对虾源中副溶血弧菌的流行情况,耐药基因的携带率以及耐药表型与基因型的相关性,为水产养殖中副溶血弧菌的病害防治以及副溶血弧菌中耐药机制的研究提供基础数据;最后对36株副溶血弧菌及采自江苏赣榆的创伤弧菌和鳗弧菌中qnr VC基因进行检测及基因定位,可转移性评价以及基因环境分析,了解qnr VC基因在弧菌中的流行情况,解析qnr VC基因的遗传背景及其转移机制,为水产养殖源耐药弧菌以及耐药基因传播扩散的防控提供基础数据支持。1.养殖源弧菌的流行情况调查本实验从四个地区共分离到弧菌70株,使用TCBS选择性培养基进行分离纯化,生化鉴定和分子生物学鉴定方法鉴定,结果显示分离最多的是副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),为36株,占总量的51.4%,其次为哈维氏弧菌19株,占27%。其中不同地区分离到的弧菌数量不同,上海郊区、江苏以及福建地区分离到的副溶血弧菌的数量比较多,海南地区分离到的哈维氏弧菌比较多,这可能与菌株的流行区域与采集的样本数有关。养殖源弧菌流行情况的调查可为弧菌病害的防治及用药提供指导意义。2.副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnr A、qnr B、qnr S和qnr VC,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,四环霉素类耐药基因tet A、tet B和tet M,酰胺醇类耐药基因cat、optr A、flo R和cfr,氨基糖苷类耐药基因str A、str B、aad A和aac A,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因bla CARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林的耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1%(22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnr VC检出率最高达72.2%(26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srt B,检出率58.3%(21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。检测菌株的耐药基因与耐药表型不是完全对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。3.qnr VC基因介导的弧菌的喹诺酮耐药性研究首先检测36株副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌两株弧菌中qnr VC基因的携带情况,结果显示有26株副溶血弧菌携带耐药基因,其中21株携带的是qnr VC6等位基因,5株携带的是qnr VC3等位基因,创伤弧菌,鳗弧菌均携带qnr VC9等位基因。其次,检测了创伤弧菌、鳗弧菌两株弧菌对五种喹诺酮类药物的MIC值,结果显示创伤弧菌对环丙沙星、诺氟沙星耐药,鳗弧菌对萘啶酸耐药,两株弧菌对喹诺酮类药物的耐药性较低;再次,为了研究qnr VC基因介导的喹诺酮药物耐药机制,本研究对qnr VC阳性菌株进行结合转移实验,结果显示:只有2株菌(创伤弧菌和鳗弧菌)的qnr VC基因转移成功,2株弧菌阳性接合子对环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星和萘啶酸五种喹诺酮药物的MIC值跟受体菌相比,均发生了变化,J53-Vv菌株的MIC值依次分别提高了8倍、4倍、4倍、16倍和1倍;J53-Va对五种药物的MIC值依次分别提高了16倍、4倍、4倍、32倍和4倍;采用Primer Walking研究其基因环境,结果显示:创伤弧菌和鳗弧菌携带的qnr VC基因位于7000-8000bp左右的质粒上。质粒测序结果经过blast分析比对之后,显示创伤弧菌和鳗弧菌中的qnr VC基因均与1类整合子携带的耐药基因盒dfr6相连接,qnr VC基因的传播可能与1类整合子相关联。最后对鳗弧菌上的qnr VC9基因进行敲除,使用自杀质粒p CVD442构建qnr VC9基因敲除菌株,为之后qnr VC9基因的功能研究提供基础。这提示质粒介导的喹诺酮耐药菌株有将耐药基因通过质粒传播的风险,对于养殖源弧菌病害防治以及喹诺酮类药物的合理使用具有指导意义。