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背景：胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种双重分布在中枢神经系统和胃肠道的脑肠肽,并以神经递质的形式参与了多种生理及病理过程。硫酸化胆囊收缩素八肽(sulfated cholecystokinin octapeptide, CCK-8S)是具有CCK完全生物学功能的最小活性片段。已知CCK主要通过两种受体发挥其不同的生理及药理作用,即CCK1受体(cholecystokinin-1 receptor)和CCK2受体(cholecystokinin-2 receptor)。前期关于CCK的研究多偏重于其在胆囊、胰腺及心肺功能活动中的调节作用。近年来,随着功能性胃肠病发病率日益增高,有关CCK调节胃肠动力的作用引起人们的高度重视。多项研究显示功能性胃肠病患者血清中CCK存在异常,但有关CCK对胃肠平滑肌的具体作用机制报道较少。第一部分目的：探讨CCK-8S对豚鼠近端结肠平滑肌肌条自发性收缩频率和强度的影响及可能的作用机制。方法：取6 cm左右豚鼠近端结肠,在持续充以95%02和5%CO2的Ca-freePSS中去除黏膜后剪成8 mm×10 mm平滑肌肌条,并将纵行肌与环行肌分离。将肌条浸没于37℃含钙台式液中,一端固定于垂直灌流槽,另一端与张力换能器相连,并持续充以95%O2和5%C02的混合气体。待肌条出现自发节律性收缩并稳定后采用RM6240多道生理信号采集处理系统记录给药前后收缩频率和强度。结果：CCK-8S (10-7 mol/L)作用后,豚鼠结肠平滑肌纵行与环形肌条的收缩幅值分别为对照组的156.53%±11.92%(n=15,P=0.038)和165.93%±12.98%(n=15,P=0.019)；结肠平滑肌纵行肌条的收缩频率为对照组的131.69%±13.58%(n=15,P=0.023),而环形肌条的收缩频率无明显变化,为对照组的102.19%±8.96%(n=15,P=0.087)。当预先将灌流液中分别加入CCK1受体拮抗剂devazepide、L-型钙通道阻断剂nifedipine、大电导钙依赖钾通道阻断剂iberiotoxin、钙泵抑制剂thapsigargin (TG)和钙离子螯合剂BAPTA-AM (BA)后,CCK-8S对结肠平滑肌肌条的增强效应被抑制(n=15,均P<0.05)；而预先加入CCK2受体拮抗剂CI 988后,CCK-8S的增强效应仍然存在(n=15,P>0.05)。结论：CCK-8S通过CCK1受体能促进豚鼠近端结肠纵,环行平滑肌自发性收缩强度及纵行平滑肌收缩频率；但对环行平滑肌收缩频率无明显影响。其机制与促进平滑肌细胞内钙的释放、胞膜上大电导钙依赖钾通道及L-型钙通道的激活有关。第二部分目的：探讨CCK-8S对单个豚鼠结肠平滑肌细胞静息电位(：resting potential, RP)、动作电位(action potential, AP)、大电导钙依赖钾通道电流(large conductance potassium currents,IBKca)和L-型钙通道电流(L-type calcium currents, ICa-L)的影响及可能的作用机制。方法：取6 cm左右近端结肠,在持续充以95%02和5%CO2的Ca-free PSS中去除黏膜后剪成2 mm×6 mm大小,置于无钙消化液中,37℃振荡孵育20-30min,漂洗,吹打成细胞悬液。将细胞悬液接种于装有倒置显微镜的灌流槽中,贴壁后,用含钙台式液以2-3 ml／min速度持续灌流,并选取贴壁良好,折光性好,胞膜光滑清晰的杆状细胞进行高阻封接。用EPC-10膜片钳放大器记录结肠平滑肌细胞AP和RP给药前后的变化；在穿孔全细胞膜片钳模式下记录单个细胞IBKca和ICa-L给药前后的变化。结果：1.CCK-8S (10-7 mol/L)作用后,结肠平滑肌细胞RP、AP峰值及AP快速复极时间分别为对照组的48.6±5.3%、138.6%±3.2%和63.1±8.7%(n=8,P=0.032、0.015和0.026),该效应可被预先加入的devazepide和／或nifedipine阻断(均n=8,P<0.05),而预先向灌流液中加入CI 988后,CCK-8S对RP、AP峰值及AP快速复极时间的作用仍存在。2.从-60 mV去极化至+100 mV,CCK-8S可剂量依赖性升高IBKca(P<0.05,at 10-8,10-7和10-6mol／L；ECso=3.5×10-8mol／L)。CCK-8S(10-7mol／L)升高IBKca为对照组的118.7%±2.1%(从916±183 pA至1088±226 pA；n=8,P=0.029),该效应可被预先向灌流液中加入的devazepide抑制(908±109pA,n=8,P=0.012 vsCCK-8S组,P=0.083vs对照组),但CI 988无明显抑制作用(1052±196 pA,n=8,P=0.098 vsCCK-8S组)。当向电极内液加入IP3受体阻断剂肝素(10-5mol／L)或向细胞外液加入蛋白激酶C拮抗剂staurosporine(10-6mol／L)后,CCK-8S(10-7mol／L)对IBKca均没有影响(879±117 pA,n=8,P=0.074vs对照组,P=0.016 vsCCK-8S组；887±120 pA,n=8,P=0.069 vs对照组,P=0.041 vs CCK-8S组)。3.从-60 mV去极化至+10 mV,CCK-8S可剂量依赖性升高ICa-L(P<0.05,at 10-8,10-7和10-6mol／L；EC50=3.2×10-8mol／L)。CCK-8S(10-7mol／L)升高ICa-L为对照组的140%±5.3%(从60±8 pA至84±11 pA,n=8,P=0.012),该效应可分别被预先向灌流液中加入的devazepide(61±9 pA；at+10 mV；n=8,P=0.023 vs CCK-8S组,P=0.079 vs对照组),TG和BA抑制(7±5 pA；at+10 mV,n=8,P=0.006 vs CCK-8S组),但CI 88无明显抑制作用(84±11pA；n=8,P=0.079 vs CCK-8S组)。当向电极内液加入IP3受体阻断剂肝素(10-5mol／L)或向细胞外液加入蛋白激酶C拮抗剂staurosporine(10-6mol／L)后,CCK-8S(10-7mol／L)对ICa-L均没有影响(63±12 pA,65±10 pA；at+10 mV；n=8；P=0.183,0.215vs正常组,P=0.042,0.032·vs CCK-8S组)。结论：CCK-8S通过CCK1受体促进近端结肠平滑肌细胞内钙库释放钙及增强肌细胞膜ICa-L,促进细胞外钙内流,从而使平滑肌细胞RP下降,AP幅值增加；通过增强细胞膜IBKca使平滑肌细胞AP快速复极时间缩短,从而增加了单位时间内AP次数,促进结肠平滑肌细胞收缩。其作用机制与激活IP3介导的PKC途径有关。第三部分目的：检测胆囊收缩素受体基因在豚鼠近端结肠平滑肌的表达。方法：取新鲜的豚鼠近端结肠平滑肌组织,在装有生理盐水的烧杯中去除肠内容物,然后在持续充以95%02和5%CO2的Ca-free PSS中去除粘膜层及粘膜下层,取50-100 mg新鲜组织在冰浴中匀浆,离心后,吸取上清,应用逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测CCK1受体及CCK2受体mRNA在豚鼠近端结肠平滑肌组织中的表达。结果：豚鼠近端结肠平滑肌组织中有CCK1受体mRNA表达(0.83±0.15,n=15,P=0.263vsβ-actin),扩增产物片段大小为630bp,但未见CCK2受体mRNA的表达。结论：豚鼠近端结肠平滑肌中分布的CCK受体主要为CCK1受体,这是CCK促进结肠平滑肌收缩的分子基础。