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NRAGE,即神经营养因子受体相互作用的黑色素瘤抗原基因同源物(neurotrophin receptor-interacting melanoma antigen-encoding gene homolog),起初被确定为神经生长因子受体p75NTR的一个低亲和力相互作用分子。根据以往的研究,NRAGE通过调节Dlx/Msx的功能促进肌源性分化。在胚胎发生过程中,在骨雏形软骨成分周围的细胞层中也发现了 NRAGE mRNA的强信号,进一步的研究证明NRAGE在骨形成过程中可能是Dlx家族成员的调节因子。Dlx3在成牙本质极化和牙本质形成中也起着关键作用。NRAGE参与激活非典型骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路。同时,BMP信号通路在牙齿发育和调节牙髓细胞增殖分化中发挥重要作用。成牙细胞和成骨细胞有许多相似之处。因此,我们推测NRAGE可能在牙齿发育过程中对小鼠牙髓细胞产生影响。目的:1.培养小鼠牙髓原代细胞并进行成牙本质诱导以便进行相关研究。2.探讨NRAGE对小鼠牙髓细胞增殖与分化的影响。3.探讨NRAGE调节小鼠牙髓细胞分化所涉及的信号通路。方法:1.分离培养小鼠牙髓原代细胞原代小鼠牙髓细胞是从健康的4周龄小鼠门牙中分离培养。用眼科剪将牙髓组织轻轻的从牙齿中分离出来并切成小块(约1mm3)。组织碎片在含有10%FBS以及双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养(5%CO2,37℃)。当细胞汇合后,用胰酶进行消化传代培养。研究中使用的是第3-6代细胞。DMEM中加入10%FBS、双抗、50μg/ml维生素C、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和10 nmol/L地塞米松,配置成成牙本质诱导培养基。小鼠牙髓细胞以2万个每孔接种于6孔板中并加入成牙本质诱导培养基。2.慢病毒感染建立细胞模型在pLKO.1-puro质粒上插入了 NRAGE干扰序列或者阴性对照序列。将靶向质粒以及包装质粒在Lipofectamine 2000作用下转染进入293T细胞,病毒会在细胞内包装生产。然后用这些慢病毒和polybrene一起感染小鼠牙髓细胞。24小时后,用含有2μg/ml嘌呤霉素的培养基进行阳性筛选4-7天。3.检测增殖能力的变化敲减NRAGE之后,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹实验(Western Blot)进行敲减效率验证。利用CCK-8实验检测增殖能力变化。4.检测分化能力的变化以及可能的信号通路敲减NRAGE之后,进行成牙本质诱导,利用RT-PCR、免疫印迹实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、ALP染色、茜素红染色检测分化能力的变化,并利用免疫印迹实验和免疫荧光染色探索可能的信号通路。结果:1.小鼠牙髓细胞成牙本质分化过程中,NRAGE表达量逐渐下调。小鼠牙髓细胞成牙本质诱导过程中,成牙本质标志物牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP1)、牙本质唾液磷蛋白(dentin salivary phosphor protein,DSPP)、ALP表达逐渐上升,这表示成牙本质诱导成功。此外,NRAGE的表达逐渐下调,表示NRAGE可能对成牙本质分化有抑制作用。2.敲减NRAGE后,小鼠牙髓细胞增殖能力减弱。用慢病毒成功感染小鼠牙髓细胞后,发现成牙本质诱导不同时间点中,小鼠牙髓NRAGE敲减细胞(mDPC/shNRG)组的增殖速率明显低于正常牙髓细胞(mDPC/wt)组以及空载慢病毒感染对照细胞组(mDPC/shCon)(P<0.01)。这表明,mDPC/shNRG组的细胞增殖受到了明显抑制。3.敲减NRAGE后,小鼠牙髓细胞分化能力增强。用慢病毒成功感染小鼠牙髓细胞后,在成牙本质诱导第14天,mDPC/shNRG组的ALP染色以及矿化结节染色结果最明显。我们还发现成牙本质诱导不同时间点中,mDPC/shNRG组的成牙本质标志物DMP1、DSPP、ALP均高于正常牙髓细胞组以及mDPC/shCon组,并且诱导时间越长差异越明显。这表明NRAGE的敲减能够促进小鼠牙髓细胞的成牙本质分化。4.NRAGE可能通过NF-κB信号通路来影响成牙本质分化。用慢病毒成功感染小鼠牙髓细胞后,在成牙本质诱导过程中,发现mDPC/shNRG组的NF-κB/P105呈现下调趋势,NF-κB/p50呈现上调趋势,正常牙髓细胞组以及mDPC/shCon组趋势不明显。此外,在成牙本质诱导的正常牙髓细胞中,通过免疫荧光染色实验发现,NRAGE虽然在细胞质和细胞核中都存在,但逐渐向细胞核转移。与此同时,NF-κB(核因子κB,nuclear factor-kappaB)在诱导过程中,逐渐从细胞质转移到细胞核。并且经过14天诱导之后,NRAGE和NF-κB呈现共定位。这些结果表明,NRAGE可能通过NF-κB信号通路调节成牙本质分化。结论:小鼠牙髓细胞矿化诱导之后,NRAGE表达量下降。敲减NRAGE之后,抑制了小鼠牙髓细胞的增殖,却促进了成牙本质分化,上调了 ALP活性,相关矿化因子表达量也有所上升。在NRAGE敲减组,NF-κB/p50表达量上升,NF-κB/p105表达量下调。免疫荧光染色实验也显示NF-κB的变化和NRAGE的变化相似,两者都随着矿化过程而入核。NRAGE对小鼠牙髓细胞的增殖和分化来说是一个重要的因子,有可能是通过NF-κB信号通路来发挥作用。