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目的微小RNA (microRNA, miRNA)是近年新发现的一类非编码RNA,长度为19-25个核苷酸的单链RNA分子,广泛存在于从线虫到人类的真核生物中。miRNA具有高度的保守性；miRNA的表达具有时序性和组织特异性；成熟的miRNA与靶标mRNA序列通过完全互补配对或不完全互补配对,引起靶标mRNA的降解或翻译抑制,达到调控目的基因表达的作用。miRNA在基因调控网络中发挥重要的作用,并在细胞分化、增殖、凋亡、和肿瘤发生等方面起重要作用。人类wings apart-like (WAPAL)基因是一个新的姐妹染色单体分离调节的因子。最近的研究发现其在维护正常细胞生长和癌症发生中起着重要的作用,WAPAL基因的表达与宫颈癌的关系尤其密切。认为该基因是宫颈癌特异性癌基因。miR-15a,miR-26b在许多肿瘤中发挥抑癌基因的作用,而miR-200b在不同肿瘤组织中的表达存在明显的差异,且这三个microRNA (?)勺表达与癌症患者的治疗效果和预后显著相关。我们通过生物信息学手段发现miR-15a、miR-26b及miR-200b最有可能是WAPAL基因的靶向作用miRNA。目前,有关miRNA对VVAPAL基因表达调控的深入研究还未见报道,为了探究miR-15a、miR-26b及miR-200b对WAPAL基因调控作用,本课题做了系列研究。首先检测WAPAL基因在宫颈癌组织中表达及其与HPV感染的关系,然后检测了miR-15a、miR-26b和miR-200b在宫颈癌组织中的表达情况,结果显示miR-15a和miR-26b在宫颈癌中呈下调表达,miR-200b在宫颈癌中呈显著上调表达；WAPAL基因的表达与miR-26b的表达成负相关,与miR-200b的表达成正相关,推测miR-26b可能是WAPAL基因的靶向microRNA。因此,构建miR-26b真核表达载体,转染宫颈癌SiHa细胞,并用RT-PCR方法、Western blot方法和免疫组化方法检测了WAPAL基因在SiHa细胞中mRNA及蛋白表达情况。该研究为探讨WAPAL基因的表达调控机制及宫颈癌的基因诊断和治疗提供了新思路。方法一、病材来源选取2006年1月至2008年12月郑州大学第二附属医院病理科诊断归档的石蜡标本176例,用于WAPAL蛋白的免疫组化分析,年龄29～57岁,平均年龄43岁,其中CINⅠ29例,CINⅡ35例, CINⅢ39例,宫颈癌48例,正常宫颈组织25例,所有标本均经HE染色病理证实,所有患者术前均未进行放疗或化疗。收集2007年9月至2008年12月郑州大学第二附属医院妇科宫颈癌手术切除的36例新鲜宫颈癌标本,因妇科良性疾病切除的36例正常子宫颈标本。用于WAPAL基因mRNA的实时定量PCR分析,所有标本均经HE染色病理证实,宫颈癌标本的癌细胞数均大于80%,其中G1(高分化癌)9例,G2(中分化癌)19例,G3(低分化癌)8例,标本分为宫颈癌组和正常宫颈组。所有患者术前均未进行放疗或化疗。二、实验方法1,采用免疫组化SP法检测WAPAL蛋白在人宫颈癌组织,宫颈上皮内瘤变组织(CIN)及正常宫颈组织中的表达情况：使用实时定量PCR方法检测了宫颈癌组织和正常宫颈组织中WAPAL基因的：mRNA表达水平,用基因芯片的方法对不同宫颈病变组织HPV感染类型进行分型检测。2,应用生物信息学方法对WAPAL基因的靶向miRNA进行预测,结果示miR-15a. miR-26b及miR-200b最有可能是WAPAL基因的靶向miRNA,然后应用TaqMan实时定量PCR的方法检测miR-15a、miR-26b和miR-200b在宫颈癌组织中的表达情况。3,构建miR-26b真核表达载体,所得质粒应用脂质体Lipofectamine 2000转染宫颈癌SiHa细胞,荧光显微镜观察转染效果。采用RT-PCR方法、Westernblot方法和免疫组化方法检测WAPAL基因在宫颈癌SiHa细胞中mRNA和蛋白表达情况。三、统计学方法实验数据采用SPSS 11.0统计软件进行分析。免疫组化结果免疫积分的比较采用单因素方差分析,组间阳性率的比较采用x2检验；对于实时定量PCR结果的统计,采用独立样本t检验,分析正常宫颈组和宫颈癌组之间的表达差异情况；WAPAL mRNA的表达与miRNA表达之间的相关性检测,采用Pearson相关分析。所有检验水准a=0.05。结果1, WAPAL基因在宫颈癌中表达显著增加,随着宫颈上皮内瘤变程度的加深,WAPAL基因蛋白阳性表达率逐渐增高；相对于正常宫颈组织,宫颈癌组织中WAPAL基因mRNA呈显著高表达,高危型HPV16/18感染的宫颈病变组织中WAPAL基因蛋白的表达显著高于低危型HPV6/11感染及HPV阴性者。2,相对于正常宫颈组织,miR-15a在宫颈癌组织中表达降低(P>0.05),平均降低2.985倍；miR-26b在宫颈癌组织中表达明显降低(p<0.01),平均降低5.618倍；miR-200b在宫颈癌组织中的表达明显升高(P<0.05),平均升高45.71倍；宫颈癌中WAPAL基因mRNA的表达与miR-26b的表达呈负相关(p<0.01),与miR-200b的表达成正相关(P<0.05)。3,构建质粒经酶切鉴定及测序结果证明与miR-26b的序列相符,表明成功构建质粒,质粒转染SiHa细胞后用荧光显微镜观察到绿色荧光,证明构建质粒在SiHa细胞中成功表达,RT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示在转染miR-26b后WAPAL基因mRNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05)。结论1、WAPAL基因是宫颈癌组织特异性高表达的基因,并且与HPV感染有密切关系。2、miR-26b和miR-200b在宫颈癌组织中异常表达,且与WAPAL的表达呈显著相关,提示miR-26b可能在宫颈癌的发生过程中发挥抑癌基因的作用,而miR-200b可能在宫颈癌的发生过程中发挥癌基因的作用,为宫颈癌的基因诊断和治疗提供一新途径。3、miR-26b可能是WAPAL基因的靶miRNA,参于WAPAL基因的表达调控。