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研究目的:SND1,因为分子量为100kDa,所以又称为p100蛋白或Tudor-SN蛋白。人类SND1最初被发现是作为转录共激活因子能够激活EB病毒细胞核抗原2(Epstein-Barr virus nuclear protein2)所介导的基因表达。SND1蛋白在各物种组织和细胞中分布广泛,在牛、大鼠、小鼠等动物细胞内存在能与人工合成的人SND1抗体相结合的SND1蛋白[1]。SND1在不同生物中具有高度的保守性,参与调控细胞的多种重要生理过程。SND1蛋白具有调节基因转录和剪接加工pre-mRNA的能力,在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。但到目前为止,SND1蛋白参与上述肿瘤的发生、发展的具体机制还不清楚,有待于进一步研究。人类主要组织相容性复合体(MHC)被称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),该基因位于人染色体的第6号染色体短臂上,编码具有高度多态性的HLA抗原。HLA抗原其本质为一类糖蛋白,由一条α重链和一条β轻链非共价结合而成。HLA在人体生理、病理机制中发挥重要作用,特别是在免疫应答中能够作为递呈分子对抗原进行加工和呈递,形成MHC-抗原肽-TCR复合物启动免疫应答,并对免疫应答起到调节作用。HLA作为某些疾病的遗传标志,对通过对HLA等位基因出现频率的检测,可以作为某些疾病的产前诊断。HLA又被称移植抗原,在器官移植领域开展的针对HLA的研究为移植配型提供可重要的理论依据。机体抗肿瘤的免疫反应机制中,以细胞免疫为主导作用,与体液免疫相互调节,协同杀伤肿瘤细胞。HLA在肿瘤免疫中起到关键作用,研究HLA与肿瘤的关系,有助于了解肿瘤免疫效应中特异性抗原肽,为肿瘤的防治提供依据。葡萄糖调节蛋白94是热休克蛋白90家族中的一员[2],GRP94蛋白本身是一种序列高度保守的蛋白,存在于内质网腔中,作为内质网典型的分子伴侣参与内质网内蛋白的折叠、转运、分泌及降解[3]。同时GRP94能够参与内质网应激,当细胞内出现低糖、缺氧、酸中毒等刺激时,出现错误折叠或未折叠的蛋白质大量聚集,会诱发非折叠蛋白反应,从而导致GRP94表达升高。有文献报道,GRP94能够参与免疫应答过程中MHC类分子的合成,介导肿瘤细胞免疫原性的产生[4]。本课题将FLAG-GRP94目的基因定向导入pLVX-IRES-Puro慢病毒载体,构建人GRP94基因慢病毒载体,进一步筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株。随后在用采用FLAG-IP技术钓取HeLa细胞株内的结合蛋白,银染后质谱检测HeLa细胞株内SND1蛋白、HLA-A蛋白及GRP94蛋白的是否表达,并用免疫共沉淀的方法加以验证,从而分析研究SND1蛋白是否能够作为支架蛋白对GRP94所介导的HLA-A蛋白的合成产生影响。研究方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体p LVX-IRES-Puro中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting法检测GRP94蛋白表达量。p LVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。利用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,采用FLAG-IP法,银染后利用质谱筛选结合蛋白SND1、HLA-A、GRP94,并经免疫共沉淀验证。研究结果:(1)PCR法获得了GRP94目的基因片段,将FLAG-GPR94与慢病毒p LVX-IRES-Puro载体双酶切得到相应的片段,并连接获得重组质粒。(2)重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。(3)He La细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。(4)利用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后成功用质谱筛选出GRP94蛋白、SND1蛋白、HLA-A蛋白,通过免疫共沉淀实验GRP94 IP HLA-A、GRP94IP SND1,验证GRP94、HLA-A、SND1三者之间相互结合情况,WB检测。研究结论:本实验成功构建了人GRP94基因慢病毒载体,并通过研究首次发现并提出SND1作为一个衔接蛋白或支架蛋白存在于GRP94与HLA-A的复合物中,推测SND1能够参与MHCⅠ类分子的加工、转运、成熟及降解过程中的某个环节,发挥着对MHC I类分子抗原呈递的重要作用。