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猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,主要特征是引起仔猪呕吐,严重腹泻和致两周龄以下仔猪100%死亡率,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)是引起猪传染性胃肠炎的病原体。TGEV感染的主要靶细胞是肠道上皮细胞,同时肠道上皮细胞承担着吸收营养物质的功能,包括葡萄糖和精氨酸。之前的研究很少有报道TGEV感染对于肠道上皮细胞营养吸收的影响。猪肠上皮细胞系(IPEC-J2)是由猪空场细胞分化而来的细胞系,它为研究猪病毒感染和营养吸收提供了良好的模型。本研究主要探究了 TGEV感染对于IPEC-J2细胞葡萄糖和精氨酸吸收的影响以及进一步的调控途径,研究内容主要分为三个部分:1、TGEV对IPEC-J2细胞葡萄糖吸收影响的研究TGEV感染肠道可能导致绒毛脱落,消化酶活性降低以及影响肠道正常的营养物质吸收。葡萄糖作为最基础的营养物质,它在肠道的吸收主要依赖于葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2。试验设为空白对照组和MOI=2剂量的TGEV感染组,试验结果显示:相对于空白对照组,TGEV感染在48h后增强了 IPEC-J2细胞的葡萄糖吸收量(p<0.05),进一步的RT-PCR和Western-blotting试验发现TGEV感染在相对应的时间点导致葡萄糖转运载体SGLTI和GLUT2的mRNA水平不变,蛋白表达量升高。而且TGEV感染对IPEC-J2细胞的增殖和细胞活力没有显著的影响。综上的试验结果表明,TGEV感染通过增高葡萄糖转运载体SGLT-1,GLUT2的蛋白表达,提升了其对于葡萄糖的吸收能力。2、EGFR调控IPEC-J2细胞葡萄糖吸收的初步探究TGEV感染通过调控葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2来增强IPEC-J2细胞的葡萄糖吸收。已经有报道发现EGFR作为一种重要的信号通路分子,参与调控葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT2的表达。本研究利用构建的EGFR慢病毒表达载体,通过在IPEC-J2细胞中干扰和过表达EGFR,分别探索了 EGFR在未感染TGEV的IPEC-J2细胞和感染TGEV的IPEc-J2细胞中对于葡萄糖转运载体SGLTI和GLUT2表达的影响。试验结果表明在未感染TGEV的IPEC-J2细胞中,干扰EGFR的表达会降低SGLT1的蛋白水平(p<0.05),过表达EGFR则会升高SGLT1的蛋白水平(p<0.05),EGFR对于GLUT2的表达水平没影响。进一步的,当干扰SGLT1发现EGFR的蛋白水平也下降。在TGEV感染的细胞中,干扰和过表达EGFR试验发现EGFR的蛋白水平和SGLTI,GLUT2蛋白表达水平呈正向关系。另一方面,研究发现高浓度的葡萄糖可以促进TGEV的复制和释放。3、TGEV感染对IPEC-J2细胞精氨酸吸收影响的研究目前很少有文献报道过TGEV破坏靶细胞IPEC-J2营养吸收的机制,包括精氨酸。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)检测发现TGEV(MOI=3)感染在48h后会降低IPEC-J2的精氨酸吸收量(p<0.05)。进一步运用RT-PCR和western blotting分析发现,CAT-1的mRNA 水平和蛋白表达水平在48h以后也发生了降低(p<0.05),而CAT-2的mRNA水平没有发生明显变化。另一方面,CCK8试验发现TGEV感染对细胞的活力没有显著影响,进一步深入探讨具体的机制。PKC蛋白激活剂PMA处理进一步降低了精氨酸吸收和氨基酸转运载体CAT-1的蛋白表达(p<0.05);p-EGRR的干扰慢病毒载体和抑制剂AG1478处理则会缓解TGEV 降低的精氨酸吸收水平和氨基酸转运载体CAT-1的蛋白表达。同样的,Caveolin-1的干扰慢病毒载体处理也会缓解TGEV降低的精氨酸吸收水平和氨基酸转运载体CAT-I的蛋白表达(p<0.05)。说明p-EGFR,PKC,Caveolin-1信号蛋白参与到TGEV感染降低精氨酸吸收的过程中。同时试验还发现Caveolin-1与CAT-1的蛋白表达存在负相关性,而p-EGFR与CAT-1的蛋白表达则不具有相关性。