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目的:研究Erk 1/2/CREB/BDNF信号通路在右美托咪定减轻异丙酚诱导神经元毒性中的作用。方法:体外培养原代海马神经元至第8天(DIV 8),随机分为C组、I组、DMSO组、P组(100μM异丙酚组)、D组(10μM右美托咪定组)、PD组(10μM右美托咪定+100μM异丙酚组)、PDP组(25μM PD98059+10μM右美托咪定+100μM异丙酚组)、HDP组(10μM H89+10μM右美托咪定+100μM异丙酚组)和KDP组(25μM KG501+10μM右美托咪定+100μM异丙酚组)。C组、I组、DMSO组和D组细胞分别用新鲜培养基、脂肪乳剂、0.25%DMSO或10μM右美托咪定孵育;P组细胞用100μM异丙酚孵育3 h;PD组细胞先用10μM右美托咪定预孵育30 min后,再加入异丙酚至终浓度为100μM,继续孵育3 h;PDP组,HDP组和KDP组细胞先分别用25μM PD98059(p-Erk1/2抑制剂)、10μM H89(p-CREB抑制剂)或25μM KG501(CREB抑制剂)预孵育30min后,再加入右美托咪定至终浓度为10μM孵育30 min,最后加入异丙酚至终浓度为100μM继续孵育3 h。免疫细胞化学法特异性标记NSE鉴定海马神经元以及纯度,CCK-8法检测海马神经元活力,透射电子显微镜和流式细胞术检测神经元凋亡,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组神经元内Erk 1/2,CREB和BDNF mRNA的表达,通过Western Blot检测p-Erk 1/2、Erk 1/2、p-CREB、CREB、BDNF、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax等蛋白的表达。结果:免疫细胞化学鉴定结果:镜下海马神经元胞体,树突和轴突被染成棕色,表明海马神经元培养成功,计算10个视野内阳性细胞数得到海马神经元纯度为95.2±3.6%。CCK-8法检测神经元活力结果:与C组比较,P组、PD组、PDP组、HDP组和KDP组神经元活力显著降低(P<0.05);与P组比较,PD组神经元活力显著增高(P<0.05);与PD组比较,PDP组、HDP组和KDP组神经元活力明显降低(P<0.05)。透射电子显微镜结果:与C组比较,P组海马神经元胞体缩小,染色质边集成“新月状”,附着在核膜周边,胞核固缩,核膜内陷;与P组神经元相比,PD组神经元胞膜边缘清晰,胞质结构清晰,胞核大且圆,核膜结构完整,染色质密度均匀,核仁明显;与PD组相比,PDP组,HDP组和KDP组海马神经元胞体缩小,胞质内空泡变性,染色质边集,胞核固缩,核膜内陷。流式细胞术检测结果:与C组比较,P组、PD组、PDP组、HDP组和KDP组神经元凋亡明显增加(P<0.05);与P组比较,PD组神经元凋亡明显减少(P<0.05);与PD组比较,PDP组、HDP组和KDP组神经元凋亡显著增加(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果:各组神经元中Erk 1/2,CREB基因表达水平未见明显差异(P>0.05);与C组比较,P组、PDP组、HDP组和KDP组BDNF基因表达下调(P<0.05);与P组比较,I组、DMSO组、D组和PD组BDNF基因表达上调,PDP组、HDP组和KDP组BDNF基因表达下调(P<0.05);与PD组比较,I组、DMSO组和D组BDNF基因表达上调(P<0.05),PDP组、HDP组和KDP组BDNF基因表达下调(P<0.05)。Western Blot检测结果:各组细胞中Erk 1/2,CREB蛋白表达未见明显差异(P>0.05);与C组比较,P组、PD组、PDP组、HDP组和KDP组细胞中p-Erk 1/2、p-CREB和Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2/Bax比例显著降低(P<0.05),Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达显著升高(P<0.05);P组、PDP组、HDP组和KDP组细胞中BDNF蛋白表达显著降低(P<0.05);与P组比较,I组、DMSO组、D组和PD组p-Erk 1/2、p-CREB和BDNF蛋白的表达有所增高(P<0.05),HDP组细胞中p-Erk 1/2蛋白表达有所增高,PDP组细胞中p-Erk 1/2蛋白表达显著降低(P<0.05);PDP和KDP组细胞中p-CREB蛋白的表达有所增高(P<0.05),I组、DMSO组、D组、PD组和KDP组细胞中Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax比例显著增高,并且Cleaved-Caspase3蛋白表达显著降低(P<0.05);与PD组比较,PDP组、HDP组和KDP组细胞中p-Erk 1/2、p-CREB、BDNF和Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2/Bax比例显著降低,Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表达显著增高(P<0.05)结论:1、100μM异丙酚孵育3 h可降低体外培养的海马神经元神经元活力,诱导神经元凋亡,同时抑制p-Erk 1/2、p-CREB和BDNF等蛋白表达;2、10μM右美托咪定预孵育30 min可以减轻100μM异丙酚孵育3 h诱导体外培养海马神经元的活力下降和神经元凋亡,并上调p-Erk 1/2、p-CREB和BDNF等蛋白表达促进神经元存活;3、p-Erk 1/2的抑制剂PD98059、p-CREB的抑制剂H89和CREB的抑制剂KG501等在抑制Erk 1/2/CREB/BDNF信号通路的同时,可削弱右美托咪定对异丙酚诱导的海马神经元毒性的保护作用;结果提示右美托咪定减轻异丙酚诱导的大鼠原代海马神经元毒性作用可能与其激活Erk 1/2/CREB/BDNF信号通路有关。