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前言肝纤维化及其终末期疾病肝硬化目前仍是困扰全球的健康问题。它可以由多种疾病引起,最终可导致肝功能衰竭和门静脉高压,目前尚无有效治疗方法,终末期多需要肝脏移植。因此,了解其发病机制对其预防和治疗十分重要。目前认为肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活为肝纤维化发生发展的中心环节。静止状态下HSCs为一种储存维生素A和脂类的非实质细胞,可以维持正常情况下肝脏的基底膜基质平衡。肝脏损伤可以诱导HSCs激活,使其失去储存脂类的特征,增生并合成富含Ⅰ型胶原纤维的纤维基质。激活的HSCs还可以释放炎症因子和多种致纤维化的细胞因子,以及组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs),改变细胞外基质平衡,促进胶原纤维沉积,最终导致肝纤维化。长久以来一直认为肝纤维化是不可逆转的,但是近年来研究发现,肝纤维化是可以逆转的,其中心环节是激活的HSCs发生凋亡。因此,如何促使激活的HSCs发生凋亡成为防治肝纤维化的重要目标。目前认为HSCs的分化类似于脂肪细胞。因而一些特异性调控脂肪细胞分化的基因也可能调控HSCs的分化。CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein, C/EBP)在脂肪分化中起到重要作用。尤其是C/EBP-α可以调控前脂肪细胞的成熟和分化。我们课题组的前期研究发现C/EBP-α可以在体内和体外诱导HSCs发生凋亡。但是C/EBP-α(?)(?)肝细胞有何作用,以及其对肝细胞和HSCs的作用有无差异仍知之甚少。因此,我们采用表达C/EBP-α的腺病毒载体(Ad-C/EBP-α)在体内和体外检测C/EBP-α诱导肝细胞和HSCs凋亡的差异。此外,我们进一步研究了HSCs中C/EBP-α是否受乙酰化调控,旨在了解乙酰化调控机制在C/EBP-α诱导HSCs凋亡中的作用,以期进一步了解肝纤维化的发病机制。第一部分腺病毒介导的C/EBP-α基因诱导肝细胞和HSCs凋亡差异的体外研究目的检测腺病毒介导的C/EBP-α基因诱导肝细胞和HSCs凋亡有无差异。方法构建腺病毒介导的C/EBP-α基因Ad-C/EBP-α,分别用50,100,200MOI Ad-C/EBP-α感染大鼠肝细胞系BRL-3A和HSCs细胞系HSC-T6,48小时后采用I)NA ladder电泳、流式细胞仪、Annex inV/PI染色检测两种细胞凋亡有无差异,以及Western Blot方法检测分析各种Caspases包括Caspase3,8,9,12的表达情况,探讨C/EBP-α诱导两种细胞的凋亡途径有无差异。结果HSCs和肝细胞对C/EBP-α诱导的凋亡有显著差异。DNA ladder结果显示HSCs从50MOI开始就产生DNA ladder现象,而肝细胞直到200MOI也没有发生凋亡。流式细胞分析和AnnexinV/PI染色结果显示HSCs从50MOI时就发生显著凋亡,并呈剂量依赖性增高。而肝细胞无明显变化。WesternBlot法结果显示Ad-C/EBP-α感染后,50MOI时可以引起HSCs发生凋亡,而200MOI时才会引起肝细胞发生凋亡。Caspase9参与了两种细胞的凋亡途径,而Caspase8,12未参与Ad-C/EBP-α诱导的两种细胞的凋亡途径。Caspase9抑制剂可以显著抑制HSCs的凋亡,但仅部分抑制肝细胞的凋亡。结论Ad-C/EBP-α诱导肝细胞和HSCs发生凋亡在剂量上有显著差异,但都是与线粒体途径有关。第二部分腺病毒介导的C/EBP-α基因诱导肝细胞和HSCs凋亡差异的体内研究目的检测腺病毒介导的C/EBP-α基因对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的作用。方法采用腹腔注射CCl4建立Balb/c小鼠的肝纤维化模型。从造模第1周(早期预防组)或第6周(晚期治疗组)通过尾静脉注射Ad-C/EBP-α,10周后处死动物。采用免疫组织化学方法和Western Blot检测C/EBP-α在肝脏内的表达。透射电镜观察血窦内皮结构。眼球采血检测小鼠血清白蛋白、总蛋白、ALT、γ-GT的表达。常规HE染色和天狼猩红染色以及肝组织羟脯氨酸含量测定来检测不同实验组肝纤维化的程度；采用免疫组织化学染色检测肝组织α-SMA、PCNA表达变化。TUNEL(?)去检测肝细胞和HSCs (?)勺凋亡情况。结果尾静脉注射Ad-C/EBP-α后小鼠肝脏石蜡切片中C/EBP-α表达远远高于对照组,且主要位于HSCs内：透射电镜可见肝窦内皮窗孔逐渐消失,内皮下连续性基底膜形成,治疗后好转。常规HE染色、天狼猩红染色和肝组织羟脯氨酸含量测定证实无论是预防组还是治疗组,胶原纤维含量均显著低于对照组；血清学指标显示注射Ad-C/EBP-α后,γ-GT表达量显著下降,其他指标各组之间无明显差异。免疫组织化学染色显示Ad-C/EBP-α注射组肝组织内α-SMA阳性细胞的个数显著减少,TUNEL检测显示凋亡的主要是HSCs。结论体内感染Ad-C/EBP-α基因能有效缓解CC14诱导的小鼠肝纤维化,大大减少肝纤维化模型肝组织内α-SMA阳性细胞的个数,并且促进HSCs的凋亡,而对肝细胞无明显促凋亡作用,对肝脏功能亦无明显损伤。第三部分C/EBP-α基因诱导大鼠HSCs凋亡的乙酰化调控的探讨目的研究乙酰化对C/EBP-α诱导HSCs凋亡的作用有无影响,以及其可能的机制。方法选取不同HDACI包括TSA, SAHA以及尼克酰胺,采用不同剂量对大鼠肝细胞系BRL-3A和HSCs系HSC-T6进行处理,用CCK-8法检测其对肝细胞和HSCs生长抑制率的影响；Western Blot检测不同剂量的TSA联合Ad-C/EBP-α同时处理HSC-T6后Caspase3,8,9,12表达情况,Realtime RT-PCR以及Western Blot检测不同时间点TSA对HSC-T6内源性C/EBP-α mRNA和蛋白的表达影响,以及组蛋白乙酰化转移酶(HATs)TIP60表达的差异。应用免疫共沉淀方法检测C/EBP-α的乙酰化水平以及C/EBP-α(?)TIP60有无相互作用。结果1) TSA, SAHA和尼克酰胺三种HDACI中,TSA对HSCs的增生抑制效果远远高于肝细胞,而SAHA和尼克酰胺则相反。2)TSA本身可以诱导HSCs发生凋亡,并可以增强C/EBP-α诱导HSCs的凋亡作用。3) HSC-T6经TSA处理后,乙酰化水平增高,C/EBP-α mRNA表达量不变,而蛋白表达量增高,并与处理作用时间有关。4) HSC-T6经TSA处理后,TIP60蛋白的表达量变化与C/EBP-α表达量变化一致。结论TSA可以通过促进C/EBP-a乙酰化,增加内源性或外源性C/EBP-a蛋白的表达,从而促进HSCs发生凋亡。TIP60与C/EBP-a结合,参与了C/EBP-a乙酰化的过程。