【摘 要】
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目的在人关节软骨细胞（Human articular chongdrocytes,HC-a）中筛选SHOX基因（short stature homeobox-containing gene,SHOX）过表达和干扰的差异表达蛋白。方法1.为了得到嘌呤霉素筛选感染慢病毒载体阳性细胞的浓度,在软骨细胞培养基中加入不同浓度的嘌呤霉素,继续培养,观察软骨细胞的存活情况。2.SHOX过表达慢病毒、含有shRN
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目的在人关节软骨细胞（Human articular chongdrocytes,HC-a）中筛选SHOX基因（short stature homeobox-containing gene,SHOX）过表达和干扰的差异表达蛋白。方法1.为了得到嘌呤霉素筛选感染慢病毒载体阳性细胞的浓度,在软骨细胞培养基中加入不同浓度的嘌呤霉素,继续培养,观察软骨细胞的存活情况。2.SHOX过表达慢病毒、含有shRNA序列的SHOX干扰慢病毒、过表达空载慢病毒和干扰空载慢病毒分别感染HC-a细胞,并经过嘌呤霉素阳性筛选。3.用实时荧光定量PCR（qPCR）检测SHOX基因mRNA相对表达量,用免疫印迹（western blot）检测SHOX蛋白的相对表达量。4.选择SHOX过表达组,SHOX干扰组和未处理的HC-a细胞共三组,采用iTRAQ联合液相色谱与串联质谱的蛋白质定量技术,鉴定差异表达蛋白质。选取1.2倍比值变化且P<0.05作为筛选差异表达蛋白质的界值。5.通过Gene Ontology（GO）数据库及PANTHER分类系统,对鉴定的差异表达蛋白质进行功能注释及通路分析。结果1.选择在培养基中加入嘌呤霉素培养3天后刚好杀死所有软骨细胞的最小浓度2.5ug/ml为阳性细胞的筛选浓度。2.筛选出了各组已感染慢病毒载体的阳性HC-a细胞。3.与未处理组相比,过表达组SHOX mRNA表达上调,差异具有统计学意义（P<0.001）,干扰组SHOX mRNA表达下调,差异具有统计学意义（P<0.001）。空载对照组分别与未处理组相比,SHOX mRNA表达差异都无统计学意义（P>0.05）。与未处理组相比,过表达组SHOX蛋白表达增高,干扰组SHOX蛋白表达降低。4.与未处理组相比,在过表达组共鉴定出26种差异表达蛋白质,其中21种表达上调,5种表达下调;在干扰组共鉴定出91种差异表达蛋白质,其中其中59种表达上调,32种表达下调。共有16种蛋白质同时在过表达组和干扰组都被鉴定为差异蛋白质,其中12种蛋白质差异趋势相同,4种蛋白质差异趋势相反。5.16种重叠的差异表达蛋白质,主要涉及5种细胞组分、5种分子功能、10种生物学过程、15种蛋白质类别、13条信号通路。结论应用慢病毒载体,在HC-a细胞使SHOX基因过表达、干扰SHOX基因表达。通过iTRAQ联合液相色谱与串联质谱的蛋白质定量技术,成功鉴定出了SHOX基因过表达、SHOX基因干扰与未处理情况下的差异表达蛋白质。差异蛋白质与SHOX基因的关系有待进一步研究验证。
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