农杆菌介导的空间诱变籼型恢复系遗传转化体系的初步建立

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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物基因组学和功能组学研究的重要模式植物。近年来,遗传转化技术在水稻品种改良、基因功能检测、功能基因组研究及突变体创建等过程中发挥着越来越重要的作用。农杆菌介导的遗传转化因操作简便、外源基因插入拷贝数少、导入的外源基因较为完整等特点已成为最具发展潜力的植物遗传转化方法。然而,水稻品种间遗传差异性很大且对转化反应的基因型依赖性强,从而增大了遗传转化的复杂性和随机性,目前还未能发现适合于所有水稻品种转化的通用平台。  空间诱变育种技术是获得新种质或新基因源的有效途径之一。随着对水稻空间诱变突变体功能基因组研究的不断深入,对这些新基因的功能验证及后续的基因工程研究都必将依赖于高效的水稻遗传转化体系。因此,建立适宜本实验室材料的水稻遗传转化体系显得尤为重要。  本研究以经空间诱变获得的优良籼型恢复系航恢七号、航恢173以及我国利用最广泛的恢复系明恢63为供试材料,通过对航恢七号及航恢173的组织培养特性进行研究,初步建立了较为优化、适用于本实验室材料的水稻遗传转化体系。主要研究结果如下:  1、对三个材料的诱导培养基进行适宜激素种类及配比的研究,结果表明:航恢七号适宜的激素配比为3 mg/L2,4-D+1 mg/L NAA;而当2 mg/L2,4-D和0.5 mg/L NAA搭配使用时,对明恢63较为合适;航恢173的则为2 mg/L2,4-D+0.5 mg/L6-BA。三个材料的愈伤诱导率分别为58.90%、65.67%、71.04%。  2、对三个材料的继代培养发现,在添加麦芽糖的继代培养基上,愈伤的褐化情况明显改善。对不同的继代培养基进行比较分析,结果以NMB为基本培养基配制的组合比较适合。航恢七号不宜在继代培养基WA、S、L3上继代培养,其相应的愈伤表现松散、湿润、发白;其虽在本实验中筛选出的继代培养基N上有较高的愈伤增殖倍数,但后续的绿苗分化不理想;明恢63及航恢173对继代培养基的敏感性较弱,尤其是航恢173,在不同培养基中继代培养之后,愈伤增殖倍数并无差异。  3、在绿苗分化方面,以航恢173的表现最好,愈伤接入预分化或分化培养基后,大约一周后开始出现绿点,极易分化成苗;而航恢七号出现绿点时间较迟,部分愈伤在后续阶段褐化死亡,绿苗数较少;在分化活力方面,也以航恢173最好,即使继代四次后愈伤分化活力仍较高(64.16%);而航恢七号的绿苗分化最差,并随着继代次数的增加,分化活力有所下降;明恢63则居中。  4、水分胁迫处理,包括在预分化培养基中添加渗透剂山梨醇、提高分化培养基中琼脂浓度、对愈伤进行部分干燥处理等,都能极大地提高三个材料的绿苗分化率。在本研究中,航恢七号的表现最为明显,愈伤经过部分干燥处理后,其再生频率达到57.78%,而对照只有26.67%。  5、分析了影响农杆菌转化水稻的两个主要因素,结果发现:不同的基因型之间对潮霉素的敏感程度存在显著的差异,航恢七号合适的潮霉素浓度为30 mg/L,明恢63为60 mg/L,而航恢173则进行了两度筛选,即一筛为30 mg/L,二筛为50 mg/L。菌液浓度OD600值初步确定为0.2~0.4之间最有利于感染,并且在感染时附加振荡,效果更佳。  6、对三个籼稻品种的转基因植株进行的hpt扩增验证结果,其PCR阳性植株率都在50%以上,以接种愈伤数为基准统计的三个籼稻品种的成功转化率分别为:航恢七号为6.15%,航恢173为20.00%,明恢63为23.73%。
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