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背景与目的动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）的主要发病机制。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰是真核生物中最常见的RNA修饰方式,在ASCVD中发挥重要作用。本课题组前期工作发现,在人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HASMCs）中,过表达 m6A 去甲基化酶脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein,FTO）基因显著抑制HASMCs迁移而不影响增殖,但其具体分子机制尚待解析,平滑肌细胞特异性的FTO基因在AS发生中的作用未见报道。因此,本研究基于体内、体外实验,应用Cre-loxP系统构建平滑肌细胞特异性Fto基因敲除小鼠（Fto fl/fl;Tagln-Cre/+）,分离、培养小鼠及人原代主动脉平滑肌细胞进行表型和分子机制研究;进一步构建平滑肌细胞特异性Fto、Apoe双基因敲除小鼠（Fto fl/fl;Tagln-Cre/+;Apoe-/-）,高脂饮食诱导建立AS模型,在整体动物水平明确平滑肌细胞特异性Fto基因敲除对AS进展的影响。方法1.应用 GEO（gene expression omnibus,GEO）数据库中 GSE43292、GSE100927、GSE28829公共数据集分析FTO基因在人AS斑块中的表达模式。2.应用Cre-loxP系统建立平滑肌细胞特异性Fto基因敲除小鼠（Fto fl/fl;Tagln-Cre/+）。分离、培养Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠及对照小鼠（Fto fl/fl）原代主动脉平滑肌细胞（mouse aortic smooth muscle cells,MASMCs）,应用Transwell实验检测平滑肌细胞特异性Fto基因缺失对Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs迁移表型的影响。应用表型回复实验证实过表达FTO基因对Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs迁移增加的回复作用。3.应用二代测序技术对Fto fl/fl小鼠、Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs进行RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）。应用生物信息学方法对差异表达基因进行基因本体论（gene ontology,GO）分析和 KEGG（kyoto encyclopedia ofgenesandgenomes,KEGG）信号通路富集分析。结合文献进展,筛选FTO基因可能调节的下游靶基因。应用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,qPCR）及免疫印迹实验（western blot,WB）验证FTO基因调控 Ⅲ 型胶原蛋白 α1 链（type Ⅲ collagen alpha 1 chain,COL3A1）基因 mRNA、蛋白表达。4.应用Transwell实验检测敲低COL3A1基因对HASMCs迁移的影响;并应用表型回复实验证实COL3A1基因在FTO基因调控HASMCs迁移中的作用。5.应用放线菌素D（actinomycin D,ActD）抑制基因转录起始,证实FTO基因对COL3A1基因mRNA半衰期的影响。应用RMVar、SRAMP、RMBase数据库预测COL3A1基因mRNA潜在的m6A修饰位点。应用RNA甲基化免疫共沉淀实时荧光定量聚合酶链反应（m6A RNA immunoprecipitation-qPCR,MeRIP-qPCR）技术检测COL3A1基因mRNA特定位点的m6A甲基化水平。6.进一步在Apoe-/-背景小鼠上建立平滑肌细胞特异性Fto基因敲除小鼠（Fto fl/fl;Tagln-Cre/+;Apoe-/-）,高脂饮食诱导建立AS模型。应用油红O染色检测主动脉脂质沉积面积;应用HE染色检测主动脉根部斑块面积、坏死核心面积。实验结果1.GEO公共数据集分析结果显示,与正常血管组织或早期斑块相比,AS斑块或晚期斑块中FTO基因mRNA表达水平显著下降。提示FTO基因表达下调参与AS过程。2.建立了平滑肌细胞特异性Fto基因敲除小鼠（Fto fl/fl;Tagln-Cre/+）及对照小鼠（Fto fl/fl）;分离并培养 Fto fl/fl;Tagln-Cre/+、Fto fl/fl 小鼠 MASMCs,Transwell实验结果显示,平滑肌细胞特异性Fto基因敲除显著增强平滑肌细胞迁移能力。Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs中过表达FTO基因,部分回复敲除Fto基因所致细胞迁移能力增加。3.RNA-seq结果显示,与Fto fl/fl小鼠MASMCs相比,Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs中,1449个基因显著上调,2015个基因显著下调。GO分析表明差异表达基因显著富集于白介素分泌等生物过程;KEGG分析表明差异表达基因显著富集于细胞外基质（excellular matrix,ECM）受体调节等通路。结合文献进展,筛选COL3A1基因作为FTO基因候选靶基因。在HASMCs中过表达FTO基因显著下调COL3A1基因mRNA、蛋白水平;敲低FTO基因则显著上调COL3A1基因表达。因而,FTO基因调控靶基因COL3A1的表达。4.HASMCs中敲低COL3A1基因显著抑制细胞迁移,敲低FTO基因同时也敲低COL3A1基因,则部分逆转敲低FTO基因所致细胞迁移能力增加。表明FTO基因通过调控靶基因COL3A1表达而抑制平滑肌细胞迁移。5.mRNA稳定性实验结果表明,HASMCs中过表达FTO基因促进COL3A1 mRNA 降解,敲低 FTO 基因维持 COL3A1 mRNA 稳定。RMVar、SRAMP、RMBase软件预测结果表明COL3A1 mRNA存在m6A甲基化位点;MeRIP-qPCR实验结果表明,在HASMCs中敲低FTO基因显著降低COL3A1 mRNA特定位点的m6A水平。初步揭示了 FTO基因调控COL3A1基因表达的表观转录组学机制。6.高脂饮食诱导 Fto fl/fl;Apoe-/-小鼠、Fto fl/fl;Tagln-Cre/+;Apoe-/-小鼠 20 周,建立了 AS模型。血管油红O染色结果显示,与对照组小鼠相比,Fto fl/fl;Tagln-Cre/+;Apoe-/-小鼠主动脉脂质沉积面积显著增加约1.24倍。HE染色结果显示,与对照组小鼠相比,Fto fl/fl;Tagln-Cre/+;Apoe-/-小鼠主动脉根部斑块平均面积显著增加50%,斑块内坏死核心比例显著增加约1.1倍。本研究首次在整体动物水平证实平滑肌细胞特异性Fto基因敲除显著增强Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化表型。结论1.多个GEO数据分析显示人AS斑块中FTO基因mRNA表达水平显著下降,提示FTO基因下调表达参与AS疾病进程。2.与敲低FTO基因促进HASMCs迁移结果一致,平滑肌细胞特异性Fto基因敲除小鼠MASMCs迁移能力增加;过表达FTO基因回复Fto fl/fl;Tagln-Cre/+小鼠MASMCs迁移能力增加。3.筛选、鉴定FTO的靶基因,证实FTO基因通过负调控细胞胶原蛋白COL3A1基因表达而抑制HASMCs迁移;FTO基因影响COL3A1基因mRNA m6A甲基化水平而影响其稳定性。初步揭示了 FTO基因调控COL3A1基因表达、影响平滑肌细胞迁移的表观转录组学机制。4.首次在整体动物水平证实平滑肌细胞特异性Fto基因敲除增强Apoe-/-小鼠主动脉脂质沉积、增大主动脉根部斑块面积和斑块坏死核心面积,促进动脉粥样硬化进程。