南方野生大豆耐铝性关联分析及对铝响应的miRNA

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土壤铝毒是酸性土壤中限制植物生长的主要因素。在酸性条件下,铝毒抑制植物根系生长,影响植物对水分及其他营养元素的吸收最终影响植物产量。大豆(Glycinemax)是世界上重要的粮食和油料作物,由于大豆的遗传背景狭窄,大豆的遗传改良受到限制。野生大豆(Glycine soja Sieb.and Zucc.)是大豆的祖先,野生大豆在长期的自然选择中,形成了许多优良的特性,特别是对不良环境因素的抗性,因此野生大豆是改良大豆的重要资源,在改良大豆抗逆性中起着重要的作用。我国南方的土壤主要是酸性土壤,野生大豆长期生长在酸性土壤中,很可能形成较强的耐铝性。目前研究表明大豆的耐铝性是由多个基因控制,但是目前很少有关于野生大豆耐铝性的相关报道,同时对野生大豆耐铝的遗传和调控机制的研究也很少。因此本研究以南方酸性土壤中收集到的野生大豆材料为对象,开展对野生大豆材料耐铝性的评价,并且通过全基因组关联分析,miRNA测序和降解组测序等技术,研究对野生大豆耐铝性起作用的QTLs及野生大豆中对铝响应的miRNA及其靶基因,为进一步研究野生大豆的耐铝遗传及调控机制提供依据。主要的研究结果如下:  1)采用180对SSR标记分析205份材料的遗传多样性,共扩增出1582个等位位点,平均等位位点数目8.82个,平均基因型数目10.35个,平均主要等位位点频率0.3409、平均基因多样性值0.7587、平均多态性信息含量(PIC)0.7325、平均实测核苷酸杂合度0.0167。在五个省份中,江西野生大豆遗传多样性高于其他四个省份,其平均等位位点数目、基因型数目、基因多样性及PIC值最高,分别是7.8778、8.4833、0.7430和0.7154,而广东省的野生大豆遗传多样性最低,这四个指标分别是4.6944、4.7389、0.6445和0.6006。五省各种群间分化值(Fst)在0.0411-0.0726间,江西野生大豆与其他各省野生大豆间的分化程度较低,其中江西与福建的野生大豆的遗传分化值最低,Fst值为0.0411。对不同材料的遗传距离进行距离分析,可以将野生大豆材料分成5个类群,江西材料主要分布在第1和3类中,湖南材料主要在第2、4、5类中,广西材料主要在第2类中,福建材料主要在2和4类中,分类结果与各野生大豆的地理来源有关系。采用STRUCTURE2.2软件对205份材料进行群体结构分析,发现野生大豆群体可以划分成5个亚群和一个混合亚群,包括A(24)、B(10)、C(23)、D(91)、E(34)和一个混合亚群M(23)。该结果与遗传聚类及地理来源有一定联系,每个类群的材料大部份来自同一地区的,且遗传相似比例较高。  2)205份材料构成的野生大豆群体,根的相对伸长率变异幅度在5.56%-100.35%。77.56%的野生大豆的根的相对伸长率10%-70%之间,其中仅BW21、BW69、BW24、BW99、JW097、JW161、JW198和W336这8份材料的主根相对伸长率大于80%。在营养液栽培条件下低浓度铝胁迫具有刺激主根生长的作用,在低浓度铝处理的第15天时,除了JW81的主根生长受到抑制以外,其它野生大豆的根长显著长于对照,其中JW198、JW97、BW69、JW167和W270的主根长度分别是对照的136.64%、115.84%、125.51%、115.59%、147.14%,但是高浓度铝胁迫下各野生大豆主根的生长均受到严重抑制。在低浓度和高浓度的铝胁迫下,野生大豆根系生物量和地上部分生物量均下降,而且随着铝胁迫时间延长下降幅度增大,但是耐性材料(BW69、JW198)根系和地上部分生物量受到的影响要小于敏感的材料(JW81、W270)。  3)在野生大豆20个连锁群中共有184对SSR标记的共线性组合存在显著的连锁不平衡,这些存在LD结构的组合的D’平均值为0.3495,r2平均值为0.0122,其中D’>0.5的组合(高强度的LD结构)仅有5个,占连锁不平衡组合数的2.72%。利用线性模型和混合模型相结合的方法,在整个基因组中共找到了9个标记与对照根伸长相关、21个与铝处理下根伸长相关及12个与根相对伸长率相关的QTL,其中Sat020对对照根伸长的解释率最高,达到了17.54%,Sat258对铝处理根的伸长率解释率最大,达到了22.52%,而Satt151对铝胁迫下根的相对伸长率的解释率最大,达到了12.66%。  4)通过miRNA测序,在野生大豆对照和铝处理的miRNA文库中共发现了240个miRNA,包含124个已知的miRNA,和57个新的miRNA,另外还有59个已知miRNA的p3/p5链。野生豆特有的miRNA(gso-miR2218)的表达量最高,在对照和铝处理miRNA文库中分别有7,282和19,061个片段。对比铝胁迫下miRNA表达的差异,34个miRNA在铝胁迫下表达存在差异,14个表达下调,20个表达上调,其中PC-28-3p下调倍数最高,下调了13.36倍,而PN-miR1509b上调倍数最高,上调了10.55倍。通过qRT-PCR检测其中10个miRNA表达量的变化,有9个miRNA表达量的变化与测序结果一致。  5)通过降解组测序,91个被miRNA剪切的靶基因被成功检测出来,其中包含了86个被已知miRNA剪切的靶基因和5个被新的miRNA剪切的靶基因。80%以上的靶基因参与植物的生物过程的调控,并且在被保守的miRNA剪切的靶基因中有52的靶基因参与转录调节。大部分miRNA剪切2个以上的靶基因,其中PN-miR169剪切了CCAAT-结合的转录因子家族的9个成员。比较两个降解组文库,发现NB-ARC结构域蛋白、LRR结构域蛋白、NAM蛋白、Myb转录因子家族、生长素响应因子和阳离子转运ATPase仅在铝处理降解组文库中出现,并且这些基因与植物对抗生物和非生物胁迫相关。在对照文库中被PNmiR172h-5p剪切的膜上的甾体类受体蛋白基因(Glyma10g38150.1)与关联作图中定位在O连锁群上与野生大豆主根相对伸长率相关联的标记Satt153位置相同。
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