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大豆(Glyine max(L.)Merr.)富含植物蛋白和植物油,营养价值丰富,是重要的粮食和油料作物。磷是植物生长发育的必需元素,土壤中有效磷素不足是作物产量提高的主要限制因素之一。野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)是大豆的天然基因库,具品质优、抗逆性强等优势,因此在野生大豆中鉴定发掘出磷高效相关功能等位基因及分子标记位点,并应用于分子标记辅助育种及转基因育种,是解决大豆生产上磷“遗传学缺乏”的重要途径之一。关联分析是一种基于候选基因和全基因组扫描遗传变异与目标性状表型联系起来的分析方法,现已广泛应用于植物功能等位基因或位点的发掘。
本研究以142份华南野生大豆主要代表材料为研究对象,通过80个SSR分子标记研究了其遗传多样性、群体分化及群体结构。对139份种质资源的磷效率表型性状进行了鉴定评价。在此基础上,进一步精选了68份种质,进行了候选基因GmPAP1的同源克隆,分析了基因多态性及连锁不平衡(LD)结构。然后基于候选基因GmPAP1及全基因组扫描(SSR标记)的方法与磷效率性状进行了关联分析,检测到了与之显著关联的功能等位基因、SNPs及SSR位点。获得的主要结果如下:
1.利用80个SSR分子标记分析142份主要来源于亚热带的江西、湖南、福建及广西等省野生大豆的遗传多样性。共扩增出等位位点数707个,平均每对引物扩增出的等位位点数为8.9个,平均基因型数11.3个,平均主要等位位点频率0.3474,平均基因遗传多样性指数0.7600,平均多态性信息含量(PIC)0.7350,核苷酸杂合度平均值为0.0242,其中有18个位点杂合度为0。数据表明这些材料具有较为丰富的遗传多样性和较高的种内纯合度。不同生态区遗传多样性有所差异,江西、湖南的野生大豆遗传多样性要高于福建、广西,但其中广西的变异程度最高。四省种群分化值(Fst)在0.0412-0.0988间,广西与其它地区野生大豆的遗传分化较远,其中与江西的分化程度最远,Fst值为0.0988;福建与湖南和江西分化程度接近,分化程度最小的是江西与湖南之间的野生大豆(Fst值0.0412),推测江西可能是这几个省野生大豆遗传中心。
对所有材料进行了分子聚类,这些材料聚成4大类12小类,与地理来源基本一致,同一地区采集的基因型基本聚到一类。同时利用STRUCTR2.2软件,以各个种质与各亚群遗传相似比例≥75％为标准,将华南野生大豆划分为6大群体,包括A(23个)、B(27个)、C(18个)、D(25个)、E(18个)5个种群及一个混合群M(31个),该结果与分子聚类、地理来源有紧密联系,每个类群的材料来源大部份来自同一地区的,其遗传相似比例相对较高。
2.在高磷和低磷条件下,对139份野生大豆进行了磷效率性状鉴定,测定了冠鲜重(FSW)、冠干重(DSW)、根鲜重(FRW)、根干重(DRW)、主根长(PRL)、冠磷含量(SPC)、根磷含量(RPC)及籽粒产量(Yield)等与磷效率有关的性状。基于上述性状评价野生大豆磷效率能力高低,在高磷条件下,最大基因型值是最小的2-11倍;在低磷条件下,最大基因型值是最小的6-40倍,基因型的差异均达到了显著或极显著水平。磷效率性状值在高、低磷条件下差异很大,除主根长外,其它磷效率性状平均值在低磷条件下显著小于高磷条件下,高磷下的平均值是低磷的1.08-5倍,影响最大的是根磷含量,高磷条件是低磷条件含量的5倍。在低磷条件下,主根相对伸长2.0 cm,是对磷缺乏的一种响应机制。磷效率性状之间存在遗传相关,在高或低磷条件下生长发育指标与生理指标间的相关系数在0.7878-0.9875之间,达到了极显著水平;其它性状与产量间的相关系数在0.3436-0.5482之间,达到显著水平,表明这些性状指标对于评价磷效率具有较好的一致性。
结合低磷和高磷条件下各性状表现来看,筛选评价出一些磷效率较好的材料。其中有来自湖南的W346、W342、W343,来自江西的JW125、JW120、JW108,还有来自福建的BW18。特别是JW120等其在低磷情况下,地上部磷含量和产量都比高条件下提高,表明该品种可能存在某种机制能利用土壤中的无效磷,可作为磷高效材料用于进一步深入研究野生大豆磷效率的生理及遗传机制。
3.基于候选基因关联分析方法检测出了1个较好的功能等位基因及7个SNPs位点与磷效率显著关联。候选基因GmPAP1具有较高的多态性,68份种质资源与对照比较共有22个SNPs和6个Indels,22个SNPs中有13处发生的是转换,9处发生的是颠换,转换所占比例接近2/3,有14个发生了非同义突变。68个基因型共检测到28个单体型,各单体型频率不一样。在位点99 bp、100 bp、101 bp及528 bp、537 bp等位点之间均检测到一些较强的连锁不平衡结构(LD),其r2值在0.9以上,存在一定程度的LD衰退,衰退距离为700 bp左右。
经关联分析,在低磷条件下检测到了3性状5个变异位点的显著关联。41 bp与281 bp与产量显著关联;317 bp与根干重显著关联;528 bp和537 bp与冠磷含量显著关联,W343资源所在的GmPAP1基因序列具有较强的耐低磷功能。高磷条件下,检测到了5性状7个变异位点的显著关联。41 bp与产量显著关联;99 bp、100 bp、101 bp及317 bp既与冠鲜重有显著关联,又与冠干重有显著关联;在528 bp和537 bp分别检测到了与磷含量显著相关。
4.基于SSR分子标记关联分析方法检测了多个标记与磷效率性状显著关联。80个SSR位点间有52个存在较强的LD结构(rZ＞0.9),包括共线性的组合(同一连锁群)和非共线性的组合(不同连锁群)。LD衰减速度较慢,其衰减距离为80cM。经关联分析,在低磷条件和高磷条件下分别检测到了38个和43个位点与磷效率性状显著或极显著关联。有关联的SSR位点广泛分布于大豆20个连锁群上,大部份连锁群中都有1至多个位点与磷效率性状关联,特别是在B1、C1、D2、L及O上较多,只有少数连锁群如C2、G、H、K上没有SSR位点关联。有多个SSR位点与多个性状有关联,如Satt408、Sat_128等位点在高低磷条件下均与冠鲜重、冠干重、根干重及产量同时显著关联。
在41个与磷效率性状QTL有关的SSR位点中,21个检测出与磷效率性状具有较强的关联。从高、低磷SSR位点综合比较来看,两者共有14个SSR位点在高低条件下均与磷效率性状关联显著,并且有部份位点均与同一性状有关联,如Satt408与冠鲜重,Sat_128与冠干重,Satt187、Satt373与冠磷含量,Satt408、Sat_113与根干重等,这些位点在两种磷水平条件下关联一致,对于影响磷效率性状来说比较保守。