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基因沉默调控机制参与到基因表达调控,抑制转座子跳跃,维持基因组稳定性等多个方面。DNA甲基化是参与基因沉默调控中的一个非常重要的表观修饰。RdDM(RNA-directed DNA methylation)是迄今发现的拟南芥中唯一条可以进行从头DNA甲基化建立的途径,同时也可以维持 CHH 甲基化。DRM2(Domains Rearrange Methyltransferase 2)是该途径中催化 DNA 甲基化的甲基转移酶。关于RdDM作用机制的研究已经取得了很大的进展,但是仍然存在着一些问题亟待解决。L119是一个插入了一段包含Pro35S::NPTⅡProRD29A::LUC两个报告基因的转基因株系,在这个株系中这两个报告基因并不表达。通过EMS诱变筛选可以释放Pro35S::NPTⅡ基因表达的突变体,NPTⅡ表达可以使得植株在含有卡那霉素的培养基上生长。通过这个表型进行图位克隆得到一个突变体mcm10。进一步分析发现mcm10突变体中ProRD29A::LUC基因表达也得到释放。通过特定位点上的亚硫酸氢盐DNA甲基化测序分析,发现mcm10突变体中Pro35S::NPTⅡ上的DNA甲基化没有变化而ProRD29A::LUC上的CHH甲基化下降。通过全基因组亚硫酸氢盐DNA甲基化测序分析发现mcm10突变体中很大一部分RdDM调控位点的CHH,CHG甲基化下降。70%mcm10突变体中的CHH低甲基化DMRs可以与drm2突变体中的CHH低甲基化DMRs重叠。通过荧光定量PCR分析发现,mcm10突变体中RdDM调控位点的基因表达得到了释放。有研究表明在RdDM突变体中ROS1表达下调,mcm10突变体中ROS1基因表达也下调。这些结果都说明MCM10参与到RdDM途径中。RdDM途径分为由Pol Ⅳ和Pol Ⅴ介导的上游和下游阶段,上游和下游阶段功能破坏都会影响24 nt-siRNA的积累,但是受到影响的小RNA并不完全一样。通过Northern-blot和全基因组的小RNA测序分析MCM10突变对这两类小RNA的影响,结果显示MCM10影响下游小RNA但是不影响上游小RNA的积累,说明MCM10参与到RdDM下游过程。通过链特异性RT-PCR分析mcm10突变体中Pol Ⅴ的转录物变化发现突变体中Pol Ⅴ的转录物没有明显变化,说明MCM10不影响Pol Ⅴ转录,可能在Pol Ⅴ转录下游起作用。进一步体内和体外的蛋白互作实验发现MCM10可以和DRM2发生蛋白互作。现有的RdDM模型中Pol Ⅴ转录使得DNA双链打开,通过AGO4-siRNA与Pol Ⅴ转录物配对将DRM2招募过来,此时DRM2结合的区域是一段打开的双链区域。有报道发现植物中DRM蛋白只对双链DNA有甲基转移酶活性,对单链DNA没有活性。因此推测MCM10是否可以将打开的双链闭合,从而促进DRM2可以在双链DNA上进行DNA甲基化。体外MCM10 DNA链退火实验证实MCM10具有很强的DNA链退火活性,并且蛋白C端对其活性具有重要作用。同时通过体外甲基转移酶活性检测实验证明MCM10的DNA链退火活性可以促进DRM蛋白进行DNA甲基化。综上所述,MCM10通过其DNA链退火活性促进Pol Ⅴ转录叉上的DNA双链闭合,从而促进DRM2 DNA甲基化。本研究发现一个新的RdDM因子MCM10,对MCM10参与到RdDM过程的作用机制研究进一步完善了现有的RdDM模型。并且发现MCM10具有一个新的DNA链退火活性,对其它物种中MCM10蛋白的功能研究具有参考价值。