香蕉是典型的呼吸跃变型果实。大量的实验数据证实，跃变型果实的成熟与乙烯密切相关。乙烯被乙烯受体感知并转换成乙烯信号，乙烯信号沿其信号传导途径传递到目标功能基因后，便引发一系列与成熟相关的生理生化反应而促使果实成熟。目前利用生物技术延缓跃变型果实成熟的策略主要围绕三大方面：(1)控制乙烯的生物合成；(2)降低果实对乙烯的敏感性；(3)阻断乙烯信号传导途径。 本课题组已从香蕉中克隆与分离了乙烯受体类似基因全长cDNA，但迄今为止，由于尚未建立起完善的香蕉遗传转化再生体系，因此要确定其生物学功能难度较大，急待寻找其它模式植物作为其功能鉴定的模型。 拟南芥(Arabidopsis thaliana)是十字花科拟南芥属植物，分布广，有多种生态型，且具有个体小、生长期短、基因组小等特点，而成为分子遗传学研究中理想的模式植物。特别是在2000年底完成了对拟南芥整个基因组的测序工作后，拟南芥的基因克隆，结构与功能的研究获得了飞速发展。此外，生长在黑暗中的双子叶植物幼苗在有乙烯存在下会产生明显的形态变化，这种畸变现象称为“三重反应”。“三重反应”的产生是依靠植物具有感受乙烯并对乙烯作出反应的能力，因为乙烯感受抑制剂、乙烯生物合成抑制剂和使植物丧失乙烯反应的突变都能够阻碍“三重反应”的发生。由于拟南芥植物繁殖快、生长周期短、重现性好，在发育的早期阶段容易筛选大量个体，所以拟南芥的“三重反应”表型为初步地有效鉴定和分离突变体提供了一个简便直观可行的方法。etrl是拟南芥中第一个被鉴定的乙烯不敏感突变体。而且，相关的遗传学分析提供的证据表明，ETR1是作用于一系列影响乙烯信号转导的其他基因座的上游，具有感受乙烯的功能，是乙烯的受体。ETR1蛋白是由ETR1基因编码，ETR1作为乙烯受体在乙烯信号传导途径的初期起作用。 近几年发展起来的RNAi技术，能快速有效的关闭相应基因，使得生物体产生相应的功能缺陷表型，从而可确定对应基因的功能，且其以特异性、高效性和广泛性的优势，已经逐渐成为了一项极具潜力的基因功能研究技术。 本研究以植物拟南芥(哥伦比亚生态型)为材料，选取了功能已知的拟南芥乙烯受体ETR1基因，试图运用RNAi技术对该基因编码区区段进行分子修饰使其发生转录后基因沉默，获得相关表型的突变体，为进一步研究来自于其它植物的同源性基因的生物学功能打下良好的基础。同时，鉴于目前RNAi技术在植物基因功能鉴定领域的研究仍处于早期探索阶段，因此本论文的研究工作也可为该领域学科的发展提供重要的实验积累数据. 研究的主要结果概述如下: 1.通过相关的生物学信息分析，确定选取了位于拟南芥ETRI基因上自AUG起始密码子后约77bP的一段长约530 bp的核酸序列(551，Atlg6634o)，作为hpRNA的双链部分。 2.设计两对引物，以拟南芥(哥伦比亚生态型)总DNA为模板，PCR方法扩增得到两个片段(551和Al)。测序结果表明，克隆到的拟南芥乙烯受体ETRI基因551和Al两个DNA片段与发表的拟南芥ETRI基因(GenBank:Atlg66340)cDNA序列的对应区段长度一致，核普酸序列同源率分别为100%和99.8%，其中AI缺少一个核昔酸(G)，对应于发表的拟南芥ETRI基因cDNA序列第883bP处，推测可能是PCR扩增错配和测序仪器本身所允许的误差所致。 3.以551区段作为正向片段、Al区段作为反向片段，正反向片段连接，经测序证实连接正确后，插入(替代)植物表达载体pCAMBIA1301/2 301中的GUS基因位置并经双酶切证实，成功构建了含有CaMv 355组成型启动子且可转录hPRNA沉默结构的系列植物表达载体PCAMBIA 1301/2 301一551一Al。 4.对正反向片段551一Al的连接、回收以及测序等过程中所出现的一系列问题和现象进行了初步分析与探讨，并提出了相应的可能解决办法和建议。 5.利用直接导入法将植物表达载体pcAMBIA2301一551一Al导入农杆菌Gv3101菌株，经斑点杂交法鉴定导入成功。 6.通过农杆菌介导，利用Floral dip法转化拟南芥，经NPTll基因PCR检测初步证实外源质粒DNA己导入拟南芥的核基因组中。