目的:复方中药丹蒌片来源于国医大师雷忠义教授加减《金匮要略》名方——瓜蒌薤白白酒汤,用于治疗冠心病痰瘀互结证,本课题组前期实验发现丹蒌片可以减少小鼠心肌缺血再灌注损伤后心律失常的发生率。自噬则是真核生物细胞内广泛存在的在应激状态下分解回收自身蛋白质的生理机制。本研究专注于心脏缺血再灌注后内皮细胞的自噬现象,通过构建体内体外模型,研究丹蒌片及丹参酮ⅡA(丹蒌片主要单体成分之一)是否对缺血再灌注导致的血管内皮损伤有保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:1.选择ApoE-小鼠开展体内实验研究,通过暂时结扎小鼠冠状动脉造成心肌缺血再灌注损伤,制备痰瘀互结型心脏缺血再灌注损伤模型。所有小鼠(除雷帕霉素组)在造模前5天开始给药,连续5天;丹蒌片组用丹蒌片超微粉混悬液按1g/(kg·d)灌胃;假手术组和模型组分别予同体积生理盐水灌胃;丹参酮ⅡA组用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液腹腔注射0.4 mL;雷帕霉素组在造模前15 mins以雷帕霉素(自噬激动剂)水溶液1 mg/kg腹腔注射。造模后24小时利用小动物超声系统得到各组小鼠超声心动图,分别计算左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)来评估小鼠心功能。实验结束后采用伊文思蓝/TTC染色法计算心脏梗死面积(IA/LV),评估各组小鼠微血管损伤情况。利用免疫荧光共定位技术来标记内皮细胞标记蛋白VWF和自噬标记蛋白LC3,观察二者共同表达情况判断心脏血管内皮细胞自噬的发生。蛋白质免疫印迹法检测心尖区域组织内自噬标记蛋白表达水平,评价丹蒌片及丹参酮ⅡA是否通过自噬改善心脏损伤。2.超声提取法制备丹蒌片水提液用于体外实验。通过对人冠状动脉内皮细胞的缺氧复氧损伤建立细胞模型。内皮细胞预给药,利用免疫荧光法标记自噬标记蛋白LC3,观察造模后内皮细胞的自噬强度;利用蛋白印迹法检测自噬标记蛋白及相关通路蛋白表达水平,判断造模后内皮细胞的自噬强度及丹蒌片是否通过Akt/mTOR信号通路调节自噬。结果:1.在体内实验中,分析超声结果发现模型组LVEF和FS较假手术组有显著下降(P<0.05);而丹蒌片组LVEF和FS较模型组明显提升(P<0.05),丹参酮ⅡA组和雷帕霉素组LVEF及FS较模型组均有提升。对比伊文思蓝/TTC染色各组小鼠心脏梗死面积比例(IA/LV),模型组较假手术组有显著上升(P<0.05),我们发现丹蒌片组、丹参酮ⅡA组和雷帕霉素组较模型组梗死面积比例(P<0.05)都有所降低,丹蒌片组最为明显。在心脏冰冻切片免疫荧光结果中,模型组LC3在内皮细胞中表达较假手术组显著降低;丹蒌片组内皮细胞中LC3较模型组有明显增加;而丹参酮ⅡA组和雷帕霉素组中内皮细胞中LC3增加。蛋白质免疫印迹结果,各组间自噬标记蛋白LC3、p62、ATG5和Beclin 1表达均无差异(P>0.05)。2.在体外实验中,经过缺氧复氧造模后,模型组较空白对照组细胞活力下降49.6%。蛋白质免疫印迹检测自噬标记蛋白,模型组LC3表达较空白对照组有下调趋势,而丹参酮ⅡA组和丹蒌片组LC3表达较模型组有上调趋势,且丹蒌片组上调更为明显,另外两种自噬标记蛋白ATG5和Beclin 1结果与LC3类似;模型组p62较空白对照组有上调趋势,但丹参酮ⅡA组和丹蒌片组p62较较模型组下调趋势;在信号通路蛋白中,模型组磷酸化Akt和磷酸化mTOR较空白对照组显著升高(P<0.05),丹蒌片组磷酸化Akt和磷酸化mTOR较模型组显著下降(P<0.05),丹参酮ⅡA组磷酸化Akt较模型组显著下降(P<0.05)。免疫荧光结果中,模型组LC3在内皮细胞中表达较空白对照组明显下调;丹参酮ⅡA组和丹蒌片组LC3较模型组上调。结论:1.丹蒌片可以改善痰瘀互结型心脏缺血再灌注损伤模型小鼠的心功能,同时减轻缺血再灌注损伤造成的微循环功能障碍。丹蒌片对内皮细胞有保护作用,这可能是其心脏保护作用的原因。2.在缺血再灌注损伤后,丹蒌片和丹参酮ⅡA可以抑制Akt激活,通过Akt/mTOR信号通路来调节自噬。