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淡水养殖鱼类经常会出现细菌感染导致大量死亡的现象,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的淡水养殖鱼类的感染非常普遍,因此,开发嗜水气单胞菌疫苗非常有必要。为了评估研制减毒嗜水气单胞菌活体疫苗的可能性,本项目利用基因重组技术敲除了腐胺产生通路中的一个基因,编码胍丁胺脱亚胺酶(agmatine deiminase)的aguA,构建了aguA敲除菌株。研究了嗜水气单胞菌aguA敲除菌株的转录组、对金鱼的半数致死(LD50)浓度、细菌毒性和致病性相关指标以及免疫原性。结果显示如下:(1)利用基因重组技术构建aguA敲除菌:首先克隆出目的基因aguA两边的同源臂,通过Overlap PCR技术把同源臂片段连接起来得到融合片段,利用克隆技术将融合片段重组到革兰氏阴性菌的敲除质粒pSR47s上。经鉴定重组成功后,在辅助质粒的帮助下使重组质粒与嗜水气单胞菌的基因组之间发生同源片段的交换。利用pSR47s质粒和嗜水气单胞菌各自的抗性,在双抗培养基中培养。培养物经鉴定具有双条带(一条为融合片段长度,一条为融合片段加目的片段长度)即为同源片段交换成功。然后利用p SR47s质粒的蔗糖不耐受特点用含有高浓度蔗糖的培养基大量培养同源交换成功的菌株,同时抑制pSR47s质粒的复制,最后用融合片段两端的引物进行PCR鉴定。将经鉴定具有单条带且为融合片段长度的PCR产物送测序公司测序,测序结果与嗜水气单胞菌野生株基因组上的片段进行比对,比对结果显示:在嗜水气单胞菌基因组中成功敲除了augA。(2)在敲除augA的嗜水气单胞菌转录组中共筛选出与野生菌表达水平有差异的基因2516个,其中上调基因1126个,下调基因1390个。在下调基因中,有57个ABC转运蛋白相关基因,13个VI型分泌系统蛋白基因:tssI、hcp1、tssF、tssG、tagH、tssK、tssH、DotU family、tssH、tagO、tssA、tssM和表达PAAR蛋白的基因;11个含ATP结合盒结构域的蛋白基因;8个菌毛相关蛋白基因;5个I型分泌系统基因(hlyD),5个II型分泌系统基因;3个鞭毛相关蛋白基因;2个溶血酶亚基基因(nrfE);1个耐热溶血素基因,1个肠毒素基因,1个肠毒素家族蛋白基因(HBL/NHE),1个RTX基因(rtxA)。这些下调的毒性相关基因对嗜水气单胞菌的致病性具有很重要的作用。通过GO功能富集分析,与野生株相比,aguA敲除株下调的差异基因GO富集中最显著富集的前四个组分是:第一显著富集的是生物膜组分(membrane);第二显著富集的是磷酸烯醇丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system);第三显著富集的是碳水化合物的运输(carbohydrate transport);第四显著富集的是运输蛋白(transport),细菌生物膜组分的表达下调很可能会导致细菌毒力下降。KE GG代谢途径中,与野生株相比,敲除株下调的代谢通路共有81个,其中显著下调的前四个通路分别是:ABC转运蛋白(ABC transporters);半乳糖代谢(Galac tose metabolism);双组分系统(Two-component system);磷酸转移酶系统(Phos photransferase system)。通过对下调的基因、差异基因GO功能富集和KEGG代谢途径的分析,敲除aguA之后,嗜水气单胞菌生物膜组分、转运蛋白、分泌系统的相关基因以及毒素基因的表达水平下降,从而可能导致嗜水气单胞菌的毒性和致病性减弱。(3)用嗜水气单胞菌augA敲除株和野生株分别感染金鱼(Carassius auratus auratus),在确定半数致死浓度(LD50)的实验中发现敲除aguA后嗜水气单胞菌的毒力确实减弱了,敲除株与野生株的毒力相比下降了7.47倍。通过革兰氏染色和泳动性实验,发现aguA敲除株细胞膜的粘附性和细菌的泳动能力均减弱了。用敲除株和灭活的嗜水气单胞菌野生株对金鱼进行腹腔注射,在两周之内检测鱼血清内的免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)和溶菌酶(lysozyme,LYS)的浓度,结果显示随着免疫时间的增加,注射aguA敲除株的金鱼血清中IgM和LYS的浓度最高。表明敲除aguA的嗜水气单胞菌保留了类似野生株的免疫原性,不影响其作为活体疫苗的免疫效果。总之,敲除aguA的嗜水气单胞菌,相关毒力基因表达水平下降,细菌相关毒性和致病性指标下降,但仍保持了与野生菌种类似的免疫原性,有潜力作为今后淡水鱼类抗嗜水性气单胞菌的减毒活疫苗。