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随着新生儿重症监护医疗水平的提高和发展,早产儿存活率有明显提高,与此同时早产儿支气管肺发育不良（broncho-pulmonary dysplasia,BPD）,发病率也有明显增加;由于早产儿的肺血管内皮细胞对高氧、炎症引起的氧化损伤特别敏感,因此接受机械通气、氧疗后的早产儿肺出现肺水肿、肺淋巴管扩张、肺纤维化为主要病理特征的BPD。同时,BPD诱导引起的后遗症状越来越多,给患儿身心健康、家庭、社会造成严重负担,引起广大新生儿科专家的关注。环核苷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）,环磷酸腺苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）是一类可被磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）,水解的细胞内第二信使,参与调理机体信号传导,生理活动。哺乳动物PDE家族由1 1个保有不同调节功能、关联结构的基因组成,各个PDE不同特性、细胞内不同亚细胞靶点、参与调节伴侣间的差异,使cAMP,cGMP信号的振幅,持续时间,终止反应等方面出现功能区别。cGMP特异性PDE可抑制PDE3或可以激活PDE2,与细胞内cAMP/cGMP存在交集信号通路（cross talk）,PDE2可调节细胞内PDE3的表达（抑制cGMP型）,PDE2、PDE3的共同存在使cAMP信号在定位、持续时间和强度上受到cGMP的调控。C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide,CNP）是钠尿肽家族（natriuretic peptides,NPS）的组成部分之一,其与细胞膜上钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor,NPR）连和,产生排钠利尿、降血压、舒张血管、平衡水电解质紊乱等功效。钠尿肽受体,跟鸟苷酸环化酶（颗粒型）结合,诱导上调cGMP含量,增多的cGMP,进一步激活上调蛋白激酶（cGMP dependent protein kinase,PKG）,参与生理反应。因此,本课题利用高氧诱导肺损伤新生大鼠模型,探究cGMP信号通路是否参与高氧诱导引起肺损,在此基础上,进一步阐明外源性CNP在高氧诱导肺损伤cGMP-PDE3-cAMP信号通路中的干预作用。第一部分 cGMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用目的:探讨cGMP信号通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤作用。方法:利用足月新生Wistar大鼠制备高氧性肺损伤模型,模型制作后第1、3、7、14天不同时间内检测新生大鼠体重、肺组织含水量;观察肺病理形态学改变;测定肺组织SOD,MDA,CAT含量;采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α、IL-1 β、IL-6、cAMP、cGMP 表达含量;利用 Western Blotting 方法检测 PDE2A、PDE3A、PDE3B,p-VASP表达水平;TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平;利用RT-PCR法检测PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA 表达。结果:1.体重测定结果:高氧组与对照组对比,高氧第3、7、14天体重与对照组同一天对比明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。各组第1天体重无明显变化。2.肺组织含水量测定结果:与正常组对比,高氧组第3、7、14天肺组织含水量明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。各组第1天肺组织含水量无明显变化。3.肺组织形态学改变结果:HE染色结果示,与同一天对照组相比,高氧组第3、7、14天新生大鼠肺组织形态学可见,肺组织结构紊乱。高氧暴露时间延长,肺泡结构简单化、数目明显减少,可见大量炎性细胞渗出,有的肺泡塌陷,肺泡出血,肺泡上皮细胞脱落。4.肺组织SOD、MDA、CAT测定结果:与正常组对比,高氧组第1、3、7、14天新生大鼠SOD,CAT含量较同一天对照组明显减少（P<0.05）;高氧组第1、3、7、14天新生大鼠MDA含量较同一天对照组明显升高（P<0.05）。5.BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定:与对照组同一天比较,高氧组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第1、3、7、14天时,明显增高,差异显著（P<0.05）。TNF-α、IL-1 β、IL-6含量随延长高氧暴露时间逐渐增高,第7天时达到高峰。6.高氧肺组织中cAMP、cGMP含量变化:与对照组相比,高氧组大鼠肺组织中第1、3、7、14天时,cAMP、cGMP表达明显降低（P<0.05）,随着高氧暴露时间延长,cAMP、cGMP含量逐渐减少,第14天时达最低值。7.Western Blot结果:与对照组同一天相比,高氧组第1、3、7、14天PDE2A,蛋白表达未见明显变化;与对照组同一天相比,高氧组第1、3、7、1 4天PDE3A,PDE3B蛋白表达上调;高氧组1、3、7、14天p-VASP蛋白表达低于同一天对照组。高氧组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1 β、IL-6蛋白在1、3、7、14天时,与对照组同一天比较明显增高,差异有显著性差异（P<0.05）。8.RT-PCR结果:与对照组同一天相比,高氧组1、3、7、1 4天PDE2A mRNA表达未见明显变化;与对照组同一天相比,高氧组1、3、7、14天PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达上调,随着时间延长mRNA表达逐渐增高。结论:1.高氧可诱发肺水肿、氧化应激及炎症反应。2.高氧诱导破坏cGMP,PKG活性,进而上调PDE3A,PDE3B蛋白表达,提示cGMP信号通路参与高氧诱导的肺损伤。第二部分 CNP-cGMP-PDE3-cAMP信号交叉对高氧诱导新生大鼠肺损伤的保护作用目的:观察CNP通过cGMP-PDE3-cAMP途径保护高氧诱导新生大鼠肺损伤。方法:选择Wistar新生大鼠建立新生大鼠高氧模型后,分为3组①对照组,②高氧组（85%O2）,③高氧+CNP组。高氧+CNP组腹腔注射CNP,1、3、7、14天天不同时间内检测新生大鼠体重、肺组织含水量;观察肺组织病理形态学改变;测定肺组织SOD、MDA、CAT含量;采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α、IL-1β、IL-6、CAMP、cGMP 的表达;利用 Western Blotting 方法检测 PDE2A、PDE3A、PDE3B表达水平;TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平;利用RT-PCR法检测PDE2A mRNA,PDE3A mRNA,PDE3B mRNA 表达;利用不同 PDE 抑制剂测定cGMP-PDE的抑制率。结果:1.体重测定结果:高氧+CNP组高氧暴露后第3、7、14天时体重与高氧组对比明显增高,均有显著性差异（P<0.05）;高氧组与同一天对照组对比明显降低（P<0.05）;各组第1天体重无明显变化。2.肺组织含水量测定结果:与同一天高氧组比较高氧+CNP治疗组第3、7、14天时,肺含水量明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,各组第1天肺组织含水量无明显变化。3.HE染色结果:HE染色结果示,与同一天高氧组相比,CNP+高氧组第1、3、7、14天新生大鼠肺组织形态学改变较同一时间高氧组好转,炎症渗出改善,肺泡结构较清晰,肺组织较前修复。4.肺组织SOD、MDA、CAT测定结果:与同一天高氧组比较;高氧+CNP组,第1、3、7、14天新生大鼠SOD、CAT含量明显上升（P<0.05）,MDA含量较同一天高氧组明显下降（P<0.05）。5.BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量测定:与高氧组同一天对比,高氧+CNP组大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量在第1、3、7、14天时,明显减少,差异有显著性差异（P<0.05）。6.高氧肺组织中cAMP、cGMP含量变化:高氧+CNP组大鼠肺组织中第1、3、7、14天时,cAMP、cGMP表达水平与对照组相比明显上升（P<0.05）。7.Western Blot结果:与高氧组相比,高氧+CNP组同一天PDE3A,PDE3B蛋白表达下调,其灰度值亦显著减少,有统计学意义（P<0.05）;与高氧组相比,高氧+CNP组第1、3、7、14天PDE2A,p-VASP蛋白未见明显变化。与高氧组同一天对比,高氧+CNP组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量在高氧组第1、3、7、14天时,明显减少,差异有显著性差异（P<0.05）。8.RT-PCR结果:与高氧组相比,高氧+CNP组第1、3、7、14天PDE3A mRNA,PDE3B mRNA表达上调（P<0.05）;高氧+CNP组PDE2A mRNA与高氧组比较无明显差异。9.不同PDE抑制剂对cAMP、cGMP变化:IBMX干预下CNP不能改变eAMP的含量,但可改变cGMP的含量差异显著（P<0.05）;EHNA干预下CNP可改变cAMP,cGMP的含量,差异显著（P<0.05）;Milrinone干预下CNP不能改变cAMP的含量,但可改变cGMP的含量差异显著（P<0.05）。IBMX的cGMP-PDE抑制率最高,其次为Milrinone。结论:1.CNP能减轻高氧诱发肺组织水肿、氧化应激、炎症反应。2.CNP-cGMP 信号途径调节 PDE3 的活性,从而影响 cAMP 含量,提示CNP-cGMP-PDE3-cAMP信号交叉,对高氧性肺损伤起保护作用。