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正畸牙移动是指牙齿在机械力的作用下通过压力侧骨吸收,张力侧骨生成来促进牙周组织改建,从而实现牙齿移动。众所周知,正畸牙移动的实质是一个无菌性炎性反应。当机械力作用于牙周膜时,压力侧的牙周膜纤维被压缩,血管血流量减少,胶原纤维和细胞基质降解吸收,细胞凋亡,促使牙周膜细胞合成分泌多种炎性因子;炎性因子作为炎症反应的调控者,招募T淋巴细胞和B淋巴细胞迁移至炎症反应区域,进而引起适应性的免疫应答。研究发现,骨组织的改建与免疫调控密切相关,表现在激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞可以调节破骨细胞分化,促进RANKL的表达,并最终通过破骨细胞的吞噬作用促进牙槽骨吸收;相反,T淋巴细胞凋亡可以抑制破骨细胞的成熟和分化,进而抑制骨吸收。有文献报道,在免疫系统中,Fas和Fas L是调节细胞凋亡的关键分子,当Fas与Fas L结合后,可诱导T淋巴细胞发生凋亡。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞,在牙周组织改建中发挥重要作用。研究发现,健康牙周组织来源的PDLSCs具有免疫抑制作用,可以促进T淋巴细胞凋亡;而炎症组织来源的PDLSCs免疫调节能力相对较弱,易导致免疫反应失衡,加速骨溶解和骨吸收。因此,健康组织来源的PDLSCs作为种子细胞,可发挥免疫调控作用,恢复受损牙周组织,促进牙齿再生和牙周组织重建。本实验拟探讨PDLSCs在正畸牙移动过程中的免疫调控作用,明确正畸牙移动的生物学机制,进而指导临床正畸治疗。为此,首先通过构建大鼠正畸牙移动模型确定PDLSCs和T淋巴细胞参与正畸牙移动;而后利用体外加力装置模拟正畸牙移动过程中牙周膜干细胞承受压力的微环境,确定压力作用下PDLSCs的免疫调控能力发生改变;最后体外构建PDLSCs与T淋巴细胞共培养模型,明确压力作用下PDLSCs的免疫调控能力对T淋巴细胞凋亡的影响。实验一大鼠正畸牙移动模型的建立及nestin和CD3的表达分布特征研究目的1)构建大鼠正畸牙移动模型并观察牙周组织形态学改变。2)观察nestin和CD3在牙周组织中的分布特征。方法1)构建大鼠正畸牙移动模型,以上颌中切牙作为支抗牙,利用镍钛螺旋拉簧,近中移动大鼠上颌第一磨牙,牵引力值为50g(0.49N)。对照组不作任何加力处理。2)取材后行HE(hemetaxylin-eosin)染色观察牙周组织形态,免疫组化染色观察PDLSCs的标记物nestin和T淋巴细胞的标记物CD3在牙周组织中的分布,免疫荧光染色双染检测T淋巴细胞的凋亡。实验结果1)镜下观察HE染色结果显示,牙周膜压力侧宽度缩窄,张力侧宽度增加。2)免疫组化染色结果显示nestin和CD3均在压力侧牙周膜中显著表达,并且随着时间的延长,表达越显著。3)免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,加力3天组牙周膜压力侧的T淋巴细胞凋亡最显著。结论1)PDLSCs与大鼠T淋巴细胞均参与正畸牙齿移动过程。2)正畸牙移动过程中确实存在大鼠T淋巴细胞的凋亡,说明PDLSCs发挥了一定的免疫调控作用。实验二可控液压细胞加载装置的建立及压力刺激下PDLSCs的免疫功能变化特征研究目的明确在压应力作用下PDLSCs的免疫调控能力发生的相应变化。方法构建一个可控液压细胞加载装置,将体外培养的大鼠牙周膜干细胞(Rat periodontal ligament cells,r PDLSCs)置于自行研发的加压力装置中,100kpa静态压力分别加力1h和12 h,检测和比较免疫相关蛋白Fas和Fas L(Fas ligand)的表达水平。实验结果1)结果显示体外加载静态压力100 kpa/1h后,r PDLSC的Fas和Fas L蛋白的表达明显高于对照组(P<0.05)。2)加载静态压力100 kpa/12h后,r PDLSC的Fas和Fas L蛋白的表达明显低于对照组(P<0.05)。结论在体外模拟正畸牙移动过程中,静态压力作用不同时间对r PDLSC的免疫活性的影响不同,100 kpa静态压力加压1 h可更有效地激活r PDLSC的免疫活性,而100kpa静态加力加压12h可抑制r PDLSC的免疫活性。实验三压应力作用下r PDLSCs促大鼠T淋巴细胞凋亡的研究研究目的明确压力刺激后的r PDLSCs对T淋巴细胞凋亡的影响。方法1)将r PDLSCs以2x105的密度接种于12孔板中,孵箱培养24h,进行体外加力100kpa/1 h和100 kpa/12 h。2)将加压刺激的r PDLSC和Con A体外激活的大鼠T淋巴细胞,按照1:10的接种比例接种,置于孵箱中共培养2天。3)收集T淋巴细胞,凋亡试剂盒染色,流式细胞仪检测T淋巴细胞的凋亡水平;western blot检测大鼠T淋巴细胞凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达水平;利用RT-PCR检测其RNA的表达水平。实验结果将应力加载后的r PDLSCs与大鼠T淋巴细胞共培养后,检测大鼠T淋巴细胞凋亡水平,结果显示,与对照组相比较100Kpa作用1h大鼠T淋巴细胞凋亡增强,作用12h大鼠T淋巴细胞凋亡减弱(P<0.05)。结论本实验将r PDLSCs与T淋巴细胞共培养后,检测T淋巴细胞凋亡水平,静压力100kpa持续作用1h,T淋巴细胞凋亡水平明显增强,作用12h后T淋巴细胞凋亡水平减弱。可以解释在一定的体外机械力作用下短时间内并不会促进破骨的分化,随着加力时间的延长破骨细胞逐渐分化,破骨能力增强,最终实现压力侧骨吸收,从而促进牙周组织的改建维持牙周内环境的稳态。