论文部分内容阅读
失眠是指无法入睡或睡眠无法保持的状态。随着现代社会生活节奏的加快,失眠日益严重地影响人们的工作、生活以及学习。目前常用于治疗失眠的化学合成药物的作用靶点大多为GABAa受体,容易产生耐药性,并且具有较强的副作用。已有大量研究表明中药提取物能够促进睡眠。许多天然药物中的成分具有疗效好、副作用小、依赖性小和药源广泛等优势而日益受到人们的关注。但是中药提取物中何种成分如何发挥作用、通过什么样的靶点发挥作用并不清楚。因此构建能够筛选中药中镇静安神成分并确定药物作用靶点的高灵敏度的药物筛选平台具有重要意义。人体睡眠由一系列受体调控,主要包括:orexin受体、melatonin受体、serotonin 受体、histamine 受体、adenosine 受体、GABAa 受体。除了 GABAa受体,另外五类受体均为G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor,GPCR)。本研究首先将两个荧光基团(eYFP和turquiose)连接到orexin受体(OXR)分子上不同部位。其中增强型的黄色荧光蛋白(eYFP)连接到OX1R/OX2R的第三胞内环,增强型的青色荧光蛋白(turquiose)连接到OX1R/OX2R分子的C末端,以pcDNA5/FRT/TO为载体构建含有VSV标签、OX1R/OX2R、eYFP和turquiose 的 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-OX1R-eYFP-turquiose和 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-OX2R-eYFP-turquiose 质粒(分子探针)。通过基因测序验证,确定连接入的基因序列正确。然后将构建完成的质粒瞬时转染293 T细胞,荧光显微镜观察到黄色荧光以及青色荧光都正常表达。同时,用市售的OXR激动剂食欲素A(OxA)处理细胞后用western blot检测pERK水平。根据OxA可以通过OXR激活下游信号通路并使ERK发生磷酸化的原理,对携带了 2个荧光基团的OXR分子探针是否仍然具有激活下游信号通路的能力做了鉴定。并证明了分子探针的有效性。在此基础上,将OXR分子探针质粒与pOG44质粒共转染入含有Zeocin抗性基因的Flp-In T-Rex HEK293细胞中,经过HygromycinB筛选两周左右,得到含有OXR分子探针基因的单克隆细胞,进一步扩大培养,建立了 Doxycyclin诱导表达OXR分子探针的Flp-In T-Rex HEK293稳定细胞系。Doxycyclin诱导稳定细胞株后,荧光显微镜观察到黄色荧光以及青色荧光正常表达,位于细胞膜上,western blot检测pERK水平确认分子探针具有OXR激活下游通路的活性。联合灌流系统和高速荧光显微镜,利用荧光共振能量转移技术(FRET)完成对受体在激动剂OxA刺激下的空间构象变化的实时监测,得到受体激活的FRET曲线,初步确定所构建药物筛选平台建立成功。在此基础上,用天麻、酸枣仁的醇提物处理诱导表达OXR分子探针的Flp-In T-RexHEK293细胞,考察提取物对受体分子探针FRET基线的影响,从而证明所筛选中药提取物中可能含有以OXR为靶点的镇静安神成分。本论文主要结果如下:(1)构建完成 pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-OX1R-eYFP-turquiose 和pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-OX2R-eYFP-turquiose 分子探针质粒。并通过瞬时转染后的荧光检测以western blot检测结果确定所构建的OXR分子探针具有OXR的功能。(2)优化分子探针后,建立诱导表达OXR分子探针的Flp-In T-Rex HEK293稳定细胞系。并通过western blot检测结果再次证明了所构建的OXR分子探针稳定株可作为后续检测的工具。(3)完成对构建的稳定细胞系FRET的监测,与western blot实验共同确立了构建的稳定细胞系可用于筛选中药提取物中的镇静安神成分。(4)对有明确镇静安神疗效的中药进行初步提取,并用提取物刺激细胞,考察提取物对受体分子探针FRET基线的影响,证明中药提取物中含有可以通过OXR发挥作用的成分。结论:本课题主要以OXR为基础,连接入eYFP和turquiose荧光蛋白,构建完成OXR分子探针质粒,并建立了诱导表达OXR分子探针的稳定细胞系,通过荧光检测以及western blot检测证实了分子探针具有OXR受体功能并可运用FRET监测药物对受体结构的影响。利用FRET技术以及GPCR与配体结合后空间结构变化的特点,构建完成了具有高灵敏度的筛选中药中镇静安神成分的平台,并对天麻、酸枣仁等中药进行了初步的筛选,致力于找到作用靶点明确的镇静安神成分。并为研发以中药为先导化合物用于治疗失眠的一类新药提供数据支持。