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第一部分:miR1-2促进BMSCs向心肌样细胞分化目的对于终末期心脏疾病,移植入诱导后的骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）可修复受损心脏,改善心功能。但是BMSCs向心肌样细胞分化的能力有限。目前采用的诱导方式往往加入外源性化学物质如5’-氮杂-脱氧胞苷酸（5’-Aza-deoxycytidine,5-aza）等,但并不能显著提高BMSCs向心肌样细胞分化的效率,而且即使在最佳诱导时间及剂量下5-aza仍避免不了对细胞的损伤。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid,micro RNA/miR）中的miR1-2是一种内源性的小分子,主要与心肌的发育有关。研究同时也发现miR1-2可以调节干细胞的分化方向。因此推测miR1-2可以调控BMSCs向心肌样细胞分化,故本实验拟证实miR1-2促进BMSCs向心肌样细胞分化,并与传统的5-aza诱导方式进行比较。方法1、体外贴壁培养BMSCs,将BMSCs细胞分成Ctrl组、miR1-2模拟组（miR1-2 mimics）、miR1-2mimics阴性对照组（miR1-2mimics negative control,miR1-2mimics NC）、5-aza组。2、5-aza诱导BMSCs后,使用qrt-PCR技术检测诱导24h、48h和72h后BMSCs内miR1-2表达水平。通过脂质体转染将miR1-2mimics转染入BMSCs。使用qrt-PCR技术检测转染24h、48h和72h后各组miR1-2的表达水平。3、qrt-PCR技术检测转染48h和72h后各组GATA4、NKx2.5和cTnI的m RNA表达水平4、WB技术检测转染72h后各组cTnI蛋白表达水平5、流式细胞仪检测转染48h和72h后各组的细胞凋亡率结果1、5-aza处理BMSCs 24h后细胞内miR1-2的水平与Ctrl组相比无明显变化（P>0.05）,但处理48h和72h后BMSCs细胞内miR1-2的水平升高,分别为Ctrl组的1.71倍和3.17倍左右,两者相比有明显的统计学意义（P<0.01）。2、转染miR1-2mimics后BMSCs内miR1-2水平明显升高,转染24h、48h和72h后分别为Ctrl组的8539、1433和690倍左右,两者相比有明显的统计学意义（P<0.001）。3、5-aza诱导BMSCs后,GATA4、NKx2.5和cTnI的m RNA水平在诱导后48h明显升高,与Ctrl组相比有统计学意义（P<0.01）。在诱导72h后,NKx2.5和cTnI的水平仍然明显高于Ctrl组。转染miR1-2mimics后,在48h和72h miR1-2mimics组GATA4、NKx2.5和cTnI的m RNA水平也高于Ctrl组,其表达量随着诱导时间延长而升高（P<0.01）。且在处理72h后,miR1-2mimics组GATA4、NKx2.5和cTnI的m RNA水平明显高于5-aza组,两者相比有明显的统计学意义（P<0.01）。4、5-aza及miR1-2mimics处理BMSCs 72h后,cTnI蛋白水平均较Ctrl组升高,差异有统计学意义（P<0.001）。且当miR1-2mimics组与5-aza组比较时,miR1-2mimics组的表达水平亦较5-aza组高,两者有统计学意义（P<0.05）。5、5-aza和miR1-2mimics处理BMSCs48h后,两者均未引起BMSCs的明显凋亡。但随着处理时间延长,5-aza逐渐引起细胞的凋亡,在处理72h后BMSCs凋亡率为16.88%,是Ctrl组的2.48倍,两者相比有明显的统计学意义（P<0.001）。而miR1-2mimics处理72h后仍未见BMSCs凋亡率的明显增加,与Ctrl组相比无统计学意义（P>0.05）结论miR1-2mimics转染BMSCs后,BMSCs可表达心肌早期发育关键因子GATA4、NKx2.5和心肌晚期结构蛋白cTnI,且在m RNA水平和蛋白水平的表达量均较传统的诱导方式5-aza高,而且miR1-2mimics对BMSCs的凋亡影响较5-aza明显减低,提示miR1-2mimics可促进BMSCs向心肌样细胞分化,而且其诱导分化率高于传统的5-aza诱导方式,也较5-aza诱导方式更为安全。第二部分:miR1-2激活Wnt信号通路促进BMSCs向心肌样细胞分化目的心脏是胚胎最早开始发育的器官之一,它的发育依赖于各种心脏发育因子、信号通路分子等在时空上的有序作用。Wnt信号通路是心脏发生发育过程中的重要信号通路,参与了心脏四腔心形成、心脏环化、心肌发育、瓣膜形成等多个过程。故推测该信号通路可能也参与了miR1-2促进BMSCs向心肌样细胞分化的过程。因此,本实验的目的即在于探寻miR1-2促进BMSCs向心肌样细胞分化的机制是否与Wnt通路的激活有关。方法1、体外贴壁培养BMSCs,将BMSCs细胞分成Ctrl组、miR1-2mimics组、miR1-2mimics NC组和Wnt信号通路抑制剂LGK-974+miR1-2mimics联合组。2、qrt-PCR检测各组Wnt信号通路β-catenin、Wnt11、JNK和TCF的m RNA水平。3、WB检测各组Wnt通路β-catenin、JNK的蛋白表达量。4、WB检测Wnt信号通路抑制剂LGK-974处理后各组GATA4、NKx2.5和cTnI蛋白表达水平。结果1、转染miR1-2mimics后,Wnt信号通路信号分子β-catenin、Wnt11、JNK和TCF m RNA的水平在转染后24h、48h及72h均较对照组高,两者相比有统计学意义（P<0.05）。当在mimics组中加入Wnt信号通路特异性抑制剂LGK-974后,β-catenin、Wnt11、JNK和TCF m RNA的表达水平明显下降,与单纯的mimics组相比有明显的统计学意义（P<0.05）。2、转染miR1-2mimics后Wnt通路β-catenin及JNK的蛋白表达量较对照组增加,有明显统计学意义（P<0.05）。当在mimics组中加入Wnt信号通路特异性抑制剂LGK-974后,β-catenin、JNK蛋白表达水平下降,与单纯的mimics组相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。3、使用Wnt信号通路特异性抑制剂LGK-974抑制Wnt信号通路后,BMSCs内心肌早期发育因子GATA4、NKx2.5和心肌特异性结构蛋白cTnI的蛋白表达水平较未使用LGK-974抑制剂的单纯mimics组明显减低,两者相比具有明显的统计学意义（P<0.05）。结论在miR1-2促进BMSCs向心肌样细胞分化过程中,Wnt通路信号分子β-catenin、JNK、TCF和Wnt11表达升高,提示在这个过程中可能有Wnt信号通路的激活。使用Wnt信号通路特异性抑制剂LGK-974后,Wnt信号通路β-catenin、JNK、TCF和Wnt11表达明显减低,同时发现由miR1-2诱发的BMSCs内GATA4、NKx2.5和cTnI的蛋白表达水平亦明显降低,进一步证实miR1-2激活Wnt信号通路促进BMSCs向心肌样细胞分化。