西瓜(Citrullus lanatus (Thunb.)Matsum & Nadai)是世界第五大水果,我国西瓜的栽培面积、总产量与人均消费量均居世界首位(FAO,2007),在我国高效农业中占有重要地位。西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveurn)寄生引起的一种真菌土传病害,是世界范围内导致西瓜产量和品质降低的最严重障碍。明确枯萎病菌与寄主植物之间的互作机理,揭示其相互作用的分子机制,可为西瓜抗枯萎病育种和病害防治奠定理论基础。尖孢镰刀菌在拟南芥、番茄、香蕉等作物上已开展了抗病防卫反应的分子机制研究,但目前有关西瓜与枯萎病菌互作的分子机理的研究尚属空白。本研究试图从组织学与转录组学二个角度系统研究西瓜与尖孢镰刀菌相互作用的机理,探索建立西瓜防御病菌的作用模型,为西瓜抗病育种与防病提供新的技术指导。本研究利用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态,从组织学的角度来阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。以抗枯萎病3个生理小种西瓜野生种PI296341-FR为材料,利用抑制差减杂交技术(SSH),构建了尖孢镰刀菌诱导抗病种质PI296341-FR防卫反应的cDNA文库,并利用一定规模的表达序列标签(EST)序列分析和微阵列芯片(microarray)技术构建了抗病防卫反应相关基因的表达谱,揭示出西瓜与枯萎病菌非亲和互作中所涉及的基因种类、数量和功能,初步推断出西瓜与枯萎病菌非亲和互作的分子机制。其主要研究结果如下:1.以农杆菌AGL1为介导,将带有潮霉素抗性基因pCH-sGFP质粒转化到西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveurn)中,成功获得了能稳定持续表达绿色荧光蛋白的枯萎病菌的突变株,对转化子进行抗性鉴定表明,组成型表达sGFP不影响枯萎病菌的致病力。2.利用激光共聚焦显微镜观察病原菌在西瓜根系的附着、侵染和定殖等过程。根系表面的孢子在接种当天,就开始萌发,菌丝沿着根系表面的纵轴方向伸长,在内部是沿着细胞间隙或细胞间的凹槽生长,菌丝在接种后的第5d就能达到维管束,在侵染后期,产生的分生孢子能再次萌发,形成二次侵染和侵染的继续扩展,最后菌丝完全充满根系组织,并伴随根系组织的瓦解,菌丝完成其定殖的过程。在抗、感品种中侧根侵染中,基本无差异,但在抗病西瓜品种的根系主根中,与感病品种存在差异,再生的孢子不萌发,侵染过程的滞后和侵染程度比较轻,说明西瓜的抗病表现在抗定殖,而不是抗侵入。根系的自然开口和伤口是病原菌优先侵染的位点,但不是枯萎病菌侵染根系所必须的,病菌可以通过形成类似附着胞的侵染结构直接侵入根系表皮的细胞。3.用SSH方法构建枯萎病菌诱导下的西瓜根系不同时间点(4h,8h,12h,24h,48h,72h,120h,192h,264h)的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息。4.本研究利用自己定制代表8000多个转录本的Agilent公司寡核苷酸的西瓜表达谱芯片,分析西瓜与枯萎病菌非亲和互作在0.5dpi,1dpi,3dpi,5dpi,8dpi中基因差异表达的情况,共筛选出679个上调基因和708个下调基因。包括转录因子、信号/调节基因、转运蛋白基因、细胞壁修饰基因、氧爆发相关的基因和防卫基因等。分析表明不同时间点特异表达的基因代表此时期的特定的反应通路,早期多是调控类的基因如转录因子、蛋白激酶等信号调控基因,在接种后期5dpi-8dpi多是些有实际作用的代谢途径中的蛋白和酶,且基因的表达多是瞬时的,很少是持续性。亲和互作和非亲和互作的QRT-PCR实验,进一步验证了JA和木质素生物合成途径参与了西瓜与枯萎病菌的互作过程,JA在西瓜与枯萎病菌互作早期起作用,木质素则相对在晚期。5.在EST序列分析基础上,利用本实验室已获得的西瓜全基因组测序和多个基因型重测序的数据,对电子克隆ClMYB和ClPR5基因的cDNA序列,进行与西瓜基因组序列比对和SNP位点的查找,ClPR5基因在多份材料中高度保守,在重测序的抗、感材料中没有氨基酸的变化;而ClMYB基因存在一个与抗、感表型大体一致的SNP位点,还需要在更多抗、感材料中进行验证。本论文在组织学和转录组学水平上,对西瓜与枯萎病菌非亲和互作进行了分析。并利用基因组测序的数据,对筛选出基因进行了分析。