脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)对个人来说是一件灾难性的事件,可以引起患者脊髓损伤节段水平以下身体的感觉和运动功能的部分或全部丧失,而且还会给家庭和社会带来一系列负面影响。近年来,大多数国家由于交通事故、暴力事件、意外情况等SCI的发病率居高不下,并有上升趋势,然而对于SCI尚没有特别有效的治疗措施和方法。因此对SCI后脊髓神经元细胞的修复、再生及其功能恢复的进一步研究具有非常重要的医疗价值和社会意义。脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后对机体功能产生的影响和损害取决于脊髓原发性损伤与继发性损伤的程度,以及损伤脊髓神经细胞自我修复和再生的能力。脊髓的原发性创伤迅速使细胞膜瓦解,破坏髓鞘、轴突及微管系统,从而释放许多有害物质引发更为严重的继发性损伤。继发性损伤是由多种细胞和分子机制启动的病理生理过程所导致的神经退行性变。这种神经退行性变不仅局限在损伤部位,还扩散到损伤周边部位。由于原发性损伤的不可逆转性,故目前医学研究和临床治疗修复损伤的方法主要是(1)针对脊髓创伤后继发性损伤的细胞分子机制,如自由基生成、一氧化氮、血小板活化因子、兴奋性氨基酸、离子紊乱、细胞炎性因子、脂质过氧化物及细胞凋亡等寻求防治措施; (2)应用神经生长因子、生长相关蛋白和血管内皮生长因子等,促进损伤脊髓神经细胞的修复和神经轴突再生。早在1944年,Berry应用电生理方法研究了周围神经再生,随后在1948年Hodes将此方法应用于临床,此后又发现刺激强度一时间曲线、神经传导速度与周围神经损伤和再生的电生理变化规律。现在,电生理学方法已成为评价周围神经损伤结构和功能修复的常用有效方法。GAP-43(growth associated proteins-43,生长相关蛋白)是80年代初发现的与神经发育、轴突再生、突触重建密切相关的一种快速转运胞膜磷酸蛋白,被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子。GAP-43蛋白及其mRNA广泛分布于大脑、小脑、脊髓、背根神经节以及自主神经系统的神经元内,在发育中的神经元沿着整个轴突表达,在生长锥表达尤其丰富。研究发现GAP-43能够通过促进肌动蛋白聚集,增强生长锥的活力,从而促进神经轴突的生长、分化、再生及突触重建。还发现GAP-43蛋白能使神经在缺乏外源性营养因子的情况下长出新突起,同时增强神经可塑性、突触重构和递质释放。GAP-43在神经系统发育过程中神经上、下通路的整合功能也是必需的。Moretto研究报道GAP-43在神经胶质细胞中也有表达,发现它与细胞骨架结构关系密切。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是1989年从牛的垂体滤泡细胞的培养基中纯化出来的,是一种血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,可促进血管内皮细胞的生长,还能通过提高血浆酶原活化因子(PA)和血浆酶原活化因子抑制因子(PAI)的mRNA水平,对PA及PAI-1活化调节作用,提高血浆酶原活化因子的活性,从而促进新生毛细血管的形成。此外,Lin发现在培养基中加入VEGF可以增加大脑皮层神经细胞的存活率和神经节细胞突起的数量和长度,促进神经生长;Jin KL报道VEGF能减少由于缺氧和营养剥夺等因素所导致海马神经元细胞的凋亡。因此,人们认为VEGF除具有促进新生血管生长的作用外,还具有直接的神经营养与保护的作用。近来发现VEGF可以通过作用于受体(VEGFR-2),快速诱导神经细胞自救、促进髓轴突再生和雪旺氏细胞生长等机制来保护损伤的脊髓神经元,促进损伤脊髓组织血管修复和神经再生。Vaquero研究发现VEGF还可以通过VEGFR-2受体促进脊髓神经胶质细胞,特别是星形胶质细胞(Astrocyte,AS)增生,分泌胶质细胞源性神经营养因子(glialcell-line derived neurotrophic factor, GDNF),GDNF发挥防止神经元的凋亡和促进轴突生长,进而间接保护神经细胞的作用。目前,脊髓损伤的结构重建和功能恢复是医学研究的热点和难点。本实验室以往的工作已经研究了SCI神经细胞的病理变化,以及神经细胞凋亡的分子机制,然而关于SCI后损伤脊髓的神经修复和再生机制仍是未解决的关键问题。鉴于GAP-43和VEGF是重要的内源性神经营养因子,并且能促进神经轴突生长和再生,而且VEGF还可以改善中枢神经生长的微环境以及保护神经元减少凋亡,所以对SCI后它们在损伤脊髓的表达时间、分布以及内在神经和血管修复的作用和机制的进一步研究具有特殊的重要意义。因此,本实验在大鼠急性脊髓损伤实验动物模型上,应用电生理技术、GAP-43和VEGF免疫组织化学的方法,研究大鼠脊髓损伤后不同时间点大鼠坐骨神经电兴奋性,GAP-43与VEGF蛋白在损伤脊髓表达的变化,初步探讨了GAP-43和VEGF在损伤脊髓中的作用及其可能机制。主要研究内容:1.大鼠SCI后不同时间点坐骨神经电兴奋性的改变为研究大鼠SCI后其功能的变化,本实验观察了正常大鼠、SCI后不同时间点最大刺激引起坐骨神经动作电位振幅、兴奋阈值和动作电位传导速度的变化。结果为: (1)大鼠SCI后不同时间点离体坐骨神经最大动作电位振幅的变化:正常对照组最大刺激产生动作电位振幅的平均值为4.18±0.21mV,而在SCI后1d,3d,5d、7d和14d,动作电位幅值分别为1.22±0.1 5、3.69±0.27 mV、2.59±0.27mV、1.82±0.17 mV和0.52±0.10mV和1.22±0.15 mV。从中观察到SCI后随着时间的进行,坐骨神经动作电位幅度呈现逐渐下降的趋势,以第7d为最低,第14d有明显升高。统计学结果表明大鼠SCI后各时间点坐骨神经动作电位幅度与正常对照组存在显著性差异(P<0.01),各SCI组之间也存在显著性差异(P<0.01)。(2)大鼠SCI后不同时间点离体坐骨神经兴奋阈值的变化:正常对照组大鼠离体坐骨神经干兴奋性最高,其产生动作电位的兴奋阈值为0.296±0.00 V;大鼠SCI后1d、3d、5d、7d和14d,兴奋闽值分别为0.302±0.011 V、0.314±0.017 V、0.374±0.028 V、0.596±0.045 V和0.386±0.033 V,从中看到随大鼠SCI后时间的推移,其兴奋阈值呈时间依赖性升高,其中以SCI后第7d为最高。经统计学处理发现SCI后3d、5d、7d和第14d,坐骨神经兴奋阈值均明显高于对照组,具有显著性差异(P<0.01)。(3)大鼠SCI后不同时间点离体坐骨神经动作电位传导速度的变化:正常对照组大鼠坐骨神经于动作电位传导速度为20.60±1.55m/s;SCI后1d,3d,5d,7d和14d传导速度均低于对照组,分别为18.42±1.74 m/s、16.80±1.55 m/s、14.47±1.40 m/s、12.21±1.20 m/s和16.02±1.72m/s,其中以第7d为最低,第14d传导速度有所回升。经统计学处理大鼠SCI后上述各时间动作电位传导速度均较对照组存在非常显著性差异(P<0.01)。以上结果表明大鼠SCI后离体坐骨神经的兴奋性和传导性均呈时间依赖性降低,利用这些客观的电生理指标可以部分的反映损伤脊髓的功能变化。2.大鼠SCI后损伤脊髓GAP-43蛋白表达的变化研究表明GAP-43是神经元发育和再生的一个内在决定因子,其在损伤脊髓的表达量直接关系到损伤脊髓内在结构和功能修复的能力。本实验用GAP-43的免疫组织化学的方法观察了大鼠SCI后不同时间损伤脊髓中GAP-43表达的变化。结果显示:大鼠正常脊髓神经元胞浆和轴突内有少量GAP-43蛋白颗粒出现,呈浅褐色,GAP-43阳性细胞数为2.53±0.77个。当大鼠SCI后神经元胞体和轴突内GAP-43蛋白表达颗粒明显增加,染色强度增加。SCI后1d、3d、5d和7d时损伤脊髓周围区GAP-43阳性神经元数量逐渐递增,分别为7.44±1.29个、10.71±2.17个、13.50±2.20个、16.33±2.96个和9.47±1.83个,其中以第7d GAP-43蛋白表达量最高。统计学结果显示大鼠SCI后各时间点GAP-43阳性神经元数量均较对照组存在非常显著性差异(P<0.01)。另外,还发现在大鼠SCI后的第7d、14d时,表达GAP-43的神经元,其胞体直径和轴突长度均较未表达GAP-43的神经元大而长。结果表明大鼠SCI后早、中期,损伤脊髓周围区神经细胞表达GAP-43蛋白呈时间依赖性的增加,提示内源性修复性机制的存在。3.大鼠SCI后损伤脊髓VEGF蛋白表达的变化VEGF具有促进损伤脊髓血管新生和神经细胞修复再生的作用。本实验利用免疫组织化学方法观察了大鼠SCI后不同时间点损伤脊髓周围区VEGF蛋白表达的变化,结果发现对照组脊髓结构完整,细胞分布均匀,VEGF表达极少;而在SCI后1d,3d和7d损伤脊髓周围区大运动神经元细胞核和胞浆内均出现较强的VEGF蛋白表达,第3d表达量最多为20.80±6.06个,与对照组0.60±0.89个比较,存在显著性差异;SCI后第14d和28d时VEGF只出现在细胞浆内,其阳性神经元数量为7.80±22.17个和2.60±1.82个,较SCI第7d时明显下降,但仍较对照组显著升高。在SCI后第3d损伤脊髓周围区的神经胶质细胞开始出现VEGF的表达,阳性神经元的数量为13.25±3.16个;14d时达高峰,为35.83±6.11个;28d时阳性神经元的数目较前减少,为21.50±4.93个;SCI各组VEGF阳性细胞数均较对照组差异非常显著差异(P<0.01)。本实验中VEGF在损伤脊髓血管内皮细胞上表达的变化是,在SCI后第1d损伤脊髓周围区血管内皮细胞VEGF表达呈强阳性,在随后的第3d、7d、14d仍有表达,而在第28d时未见表达。以上结果提示这种VEGF蛋白在大鼠SCI早、中期损伤脊髓的神经元、神经胶质和血管高表达,关于其参与损伤脊髓内源性神经结构和功能修复,以及血管新生的作用及其机制有待于深入研究。总之,本实验研究结果主要通过纪录外周坐骨神经电兴奋性变化,为反映SCI后损伤脊髓功能改变提供了客观而可靠的指标,并初步证明了SCI后不同时间点损伤脊髓内源性神经及血管结构和功能修复蛋白GAP-43和VEGF的表达和分布,这对于进一步了解SCI后其损伤脊髓组织的病理分子机制,发现有效的防治措施具有一定的理论意义和临床价值。结论:1.大鼠实验性脊髓损伤后早、中期伴发坐骨神经电兴奋性和传导性的降低。2.大鼠SCI后早、中期,损伤脊髓周围区神经细胞表达GAP-43蛋白呈时间依赖性的增加。3.大鼠SCI后早、中期,损伤脊髓周围区血管和神经细胞表达VEGF蛋白呈时间依赖性的增加。