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目的:研究砷氟联合染毒对H9c2心肌细胞毒性作用;探讨内质网应激(ERS)和细胞凋亡在砷氟联合染毒对H9c2心肌细胞损伤中的关系及作用;分析砷氟联合染毒时两者之间的相互作用关系。方法:本实验采用H9c2心肌细胞模型,砷氟单独及联合染毒按不同剂量分为9组:对照组(C组),低砷组(As10组,10μM),高砷组(As25组,25μM),低氟组(F10组,10 mg/L),高氟组(F35组,35mg/L),低砷低氟组[As10F10组,10μM(As)+10 mg/L(F)],低砷高氟组[As10F35组,10μM(As)+35mg/L(F)],高砷低氟组[As25F10组,25μM(As)+10 mg/L(F)],高砷高氟组[As25F35组,25μM(As)+35mg/L(F)]。通过CCK-8法检测砷氟联合染毒后的H9c2心肌细胞存活率;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;使用倒置显微镜、光镜和电镜观察细胞形态和超微结构的改变;检测心肌酶AST和CRE的酶活力;通过qRT-PCR法检测心肌细胞中ERS相关基因GRP78、PERK和CHOP的表达情况;通过Western-blot法检测心肌细胞中ERS和凋亡相关蛋白GRP78、PERK、CHOP和Cleaved-caspase-3的表达情况;采用免疫荧光法检测心肌细胞中ERS标志基因GRP78的表达情况。进一步,我们采用ERS抑制剂4-PBA干预后,检测心肌细胞存活率和ERS相关基因GRP78和CHOP的蛋白表达情况。统计方法采用SPSS22.0对实验数据进行单因素方差分析和析因分析。结果:1、存活率和凋亡率的改变:(1)存活率结果显示,不同剂量砷氟染毒12h和24h时,细胞存活率呈上升趋势,并达到最高;48h、72h和96h后,随着时间的延长,细胞存活率呈时间依赖性下降。且染毒24h时各染毒组中存活率比对照组均显著的降低(除As10组和As10F10组外)。(2)凋亡率结果显示,各染毒组早凋率和总凋率比对照组均显著上升。2、心肌细胞形态学的改变:(1)镜下观察:单砷组细胞体积收缩,排列紊乱,密度减小;F35组细胞排列整齐,存在少量变圆的凋亡细胞;联合染毒组细胞相互交联,密度减少,变圆的凋亡细胞明显增加。(2)HE染色:单砷组细胞数量变少,轮廓模糊,核内染色质凝集,坏死细胞数目较多;F35组部分细胞肿大,轮廓模糊,F10组无明显改变;联合染毒组的细胞有不同程度的肿大,间隙变宽,核内染色质凝集,其中As25F10组和As25F35组部分细胞核膜完整性受损,染色质凝集。3、心肌细胞超微结构的改变:(1)细胞核:F10组的细胞核无明显改变,其余各染毒组的细胞核表面有深浅不一的凹陷,核内染色质不同程度的散落在细胞边缘。As25组和F35组以及As25F35联合组的细胞核体积明显缩小。(2)内质网:单砷组细胞的内质网肿胀最严重,扩张呈池状;单氟组细胞的内质网扩张肿胀的数量明显增多且呈泡状;联合组的细胞表现为内质网脱颗粒,核蛋白体脱落、游离,扩张呈泡状或池状的数量明显增多。4、心肌损伤标志物的改变:与对照组相比,砷氟单独染毒组AST和CRE活力显著性增加(除F10组的CRE);砷氟联合染毒组中仅在As10F35组和As25F35组CRE活力显著性增加,但AST活力无显著变化。5、ERS与凋亡相关基因mRNA和蛋白表达情况:(1)mRNA表达:在各染毒组中,CHOP mRNA的表达水平均显著性升高。GRP78 mRNA的表达水平在As10F35组和As25F10组中显著性升高。PERK的mRNA的表达水平在As10F35组、As25F10组和As25F35组中显著性升高。GRP78和PERK的mRNA表达水平在其余染毒组虽然表现出上升趋势,但无统计学差异。(2)蛋白表达:在各染毒组中,GRP78、PERK和CHOP的蛋白表达水平均显著性升高,但As25组的PERK和As25F35组的CHOP无显著差异。Cleaved-casapse3的蛋白表达水平在单砷组无明显变化,而在单氟组显著升高,砷氟联合组仅在As10F10组和As10F35组中显著性升高。(3)免疫荧光ERS标志蛋白GRP78的表达:GRP78的平均荧光强度仅在As25组、F35组、As25F10组和As10F35组中显著性增强。6、抑制剂4-PBA干预砷氟染毒后,细胞存活率以及ERS相关蛋白的表达情况:(1)存活率:与各染毒组相比,抑制剂4-PBA干预后,各染毒组细胞存活率显著升高(除As10组和As10F35组外)。(2)ERS相关蛋白的表达:与染毒组相比,抑制剂4-PBA干预后,GRP78的蛋白表达量均显著下降(除F35组、As10F35组和As25F35组外),而CHOP蛋白表达量均下降,但仅在F10组和As25F10组中显著下降。7、交互作用分析结果显示,砷氟联合染毒对凋亡率的影响中,As25F10组和As25F35组中砷与氟存在协同效应,As10F10组和As10F35组中砷与氟存在拮抗效应。除此之外,砷氟联合染毒对心肌酶(AST和CRE)、内质网应激相关mRNA(GRP78和PERK)和蛋白(GRP78、PERK和CHOP)以及凋亡相关蛋白Cleaved-casapse3的影响中,砷和氟之间主要表现为拮抗效应。结论:1、砷氟联合染毒抑制了H9c2心肌细胞的存活率,改变了心肌细胞形态和超微结构(细胞核和ER),激活了心肌损伤相关酶活力,并诱导细胞发生早期凋亡,最终导致H9c2心肌细胞损伤。2、砷氟联合染毒后,首先激活了GRP78与PERK表达水平,然后启动了ERS早期凋亡因子CHOP,进一步引起了Caspase-3的激活,诱导心肌细胞发生凋亡。因此,我们分析内质网凋亡通路可能参与了砷氟联合染毒致心肌细胞损伤的过程。3、析因分析结果显示,砷氟联合染毒在对心肌损伤、ERS和凋亡影响的过程中,各个指标在砷与氟之间主要表现为拮抗效应。