【摘 要】
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研究背景:鼻咽癌是一种发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤,高发于我国广东、广西、湖南等地区。早期鼻咽癌癌肿较小,手术及放化疗治愈率高,预后较好;而中晚期鼻咽癌病变范围大,易转移,放化疗反应差,往往预后不佳。miR-4721是本课题组在EBV-miR-BART22芯片筛选中发现的差异表达miRNA分子,前期工作证实其与鼻咽癌恶性进展相关,然而miR-4721在鼻咽癌中的表达、分子功能以及作用机制目前还
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81702672）； 广州市科技计划项目（No.201804010023,201803010023）；
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研究背景:鼻咽癌是一种发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤,高发于我国广东、广西、湖南等地区。早期鼻咽癌癌肿较小,手术及放化疗治愈率高,预后较好;而中晚期鼻咽癌病变范围大,易转移,放化疗反应差,往往预后不佳。miR-4721是本课题组在EBV-miR-BART22芯片筛选中发现的差异表达miRNA分子,前期工作证实其与鼻咽癌恶性进展相关,然而miR-4721在鼻咽癌中的表达、分子功能以及作用机制目前还未有研究报道。研究内容和方法:1.EBV-miR-BART22芯片筛选及miR-4721表达检测（1）构建过表达EBV-miR-BART22 鼻咽癌细胞:瞬转 EBV-miR-BART22 mimic及 NC mimic;（2）miRNA芯片:Agilent miRNA芯片标记、杂交、扫描,提取原始信号值。对数据进行归一化、标准化后获得120个差异表达miRNA,差异筛选后进行二次验证及层次聚类分析;（3）临床样本检测:在15例正常鼻咽上皮组织及20例鼻咽癌组织中通过荧光定量PCR实验检测miR-4721表达水平。2.miR-4721在鼻咽癌中功能探究（1）MTT、EDU及平板克隆实验探究miR-4721在鼻咽癌细胞增殖中发挥的功能;（2）细胞周期实验检测miR-4721在鼻咽癌细胞周期中发挥的功能;（3）裸鼠皮下成瘤实验探究miR-4721在鼻咽癌体内生长中发挥的功能。3.miR-4721靶基因及作用通路验证（1）生物信息学网站预测miR-4721靶基因及其结合序列;（2）荧光定量PCR、Western blot及免疫组化实验探究miR-4721对GSK3β的调控;（3）双荧光素酶报告基因实验验证miR-4721靶向GSK3⒉;（4）免疫荧光检测miR-4721对β-catenin入核的调控;（5）Western blot及功能实验检测miR-4721对WNT/β-catenin通路的激活。4.miR-4721上游调控信号探究（1）生物信息学网站预测miR-4721转录因子及其结合位点:（2）荧光定量PCR实验探究转录因子SP1对miR-4721的调控;（3）ChIP、EMSA及双荧光素酶报告基因实验验证SP1与miR-4721的转录结合;（4）CoIP、ChIP实验验证C-JUN对SP1调控miR-4721的影响;（5）荧光定量PCR实验探究EBV-miR-BART22、C-JUN对miR-4721的调控。5.miR-4721与GSK3β在鼻咽癌组织中表达特征及相关性分析（1）原位杂交、免疫组化实验探究miR-4721及GSK3β的临床表达特征;（2）miR-4721与GSK3β的表达相关性分析。结果1.miR-4721受EBV-miR-BART22诱导上调,并在鼻咽癌中高表达;.2.miR-4721促进细胞周期进程及鼻咽癌生长;3.miR-4721 靶向 GSK3β激活 WNT/β-catenin 通路;4.EBV-miR-BART22/C-JUN/SP1 信号轴促进 miR-4721 转录;5.miR-4721与GSK3β在鼻咽癌中表达负相关,低miR-4721高GSK3β患者预后最佳。结论EBV-miR-BART22通过C-JUN/SP1信号轴诱导miR-4721表达,鼻咽癌中高表达的miR-4721通过靶向GSK3β从而激活WNT/β-catenin通路,促进鼻咽癌的恶性进程。
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