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当今社会,血栓性疾病的患病人数日益上涨,逐年增高,越发威胁到了人类的生命健康。血栓的定义是血液中的有形成分在器官内膜或者血管壁附着的凝块或者堆积物,引起血管狭窄或阻塞,导致各种器官和脏器缺血和梗死,其临床表现有心脑血管疾病、冠状动脉粥样硬化、肺血栓栓塞等。目前,临床上治疗血栓的药物有很多,通过调控不同的分子途径发挥抗血栓的作用,主要分为抗血小板聚集的药物、干扰凝血的药物和经纤溶酶溶栓的药物等,分别在凝血过程的不同阶段以及血栓形成的不同阶段起着抑制作用,其中医治血栓疾病最普遍是使用抗血小板的药物。但是随着抗血小板药物的广泛运用,其引发的不良反应以及出血事件等,已受到越来越多的关注。因此,探讨血小板活化的病理机制、寻找防治血小板活化的新靶点和开发安全有效的药物是目前亟待解决的问题,对于解决抗血小板药物所引起的安全性问题和预防和治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。现代医学研究发现,从温郁金的莪术油中分离出的莪术二酮,是莪术油的一种主要活性成分和常用的中药质量控制指标。长期以来研究发现,用凝血酶作为诱导剂,莪术二酮能够抑制血小板活化和聚集,在研究其作用靶点和具体作用机制时发现莪术二酮抗血小板聚集作用与vinculin/talin介导的整合素（Integrin）信号传导途径有关。不仅如此,文献报道AMPK能够调控凝血酶诱导的血小板活化。那么,AMPK是否参与vinculin/talin介导的整合素（Integrin）信号通路,进而促进血小板聚集,以及莪术二酮的具体抗凝血的作用机制尚不明确,有待进一步研究。目的:以凝血酶为诱导剂,研究莪术二酮是否影响血小板聚集,分别使用western blot和RT-PCR检测AMPK和整合素αIIbβ3信号通路相关蛋白和mRNA的表达水平,使用免疫共沉淀,荧光双染以及微量热泳（MST）的方法研究了vinculin和talin的结合,得以阐明莪术二酮抗血小板聚集的作用机制。方法:采集身体健康,近期未服用药物的志愿者的静脉血,离心,获得PRP,洗涤血小板后将血小板,分组:NS组,凝血酶组,莪术二酮组和替罗非班组。（1）分离和提取莪术二酮:称20 g莪术油,用石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脱后,上硅胶色谱柱分离,并在石油醚中重结晶,得到纯度>97%的莪术二酮。（2）莪术二酮的纯度和结构分析:使用高效液相色谱（HPLC）法进行莪术二酮的纯度分析,使用1H和13C NMR光谱进行结构鉴定。（3）血小板聚集率的检测:将生理盐水,替罗非班,不同浓度抑制剂和不同浓度莪术二酮分别加入洗涤血小板中,37℃孵育后上机,再加入0.02 U/mL凝血酶后进行聚集率检测。（4）Talin和vinculin结合域肽段的表达和纯化:根据talin R3亚结构域片段（TD,氨基酸序列795-911）和VD1亚结构域片段（VD,氨基酸序列1-258）的氨基酸序列,进行大肠杆菌密码子优化基因合成,融合蛋白表达,用Chelating（Ni）SFF亲和层析柱对目的蛋白进行富集。（5）Western blot检测蛋白的表达:分别用生理盐水,莪术二酮和替罗非班处理洗涤血小板后,用凝血酶诱导聚集,检测AMPK,vinculin,talin,整合素αIIbβ3蛋白的表达情况。（6）RT-PCR检测mRNA的表达:分别用生理盐水,莪术二酮和替罗非班处理洗涤血小板后,用凝血酶诱导聚集,检测AMPK,vinculin,talin,整合素αIIbβ3的mRNA表达情况。（7）免疫荧光双染检测talin与vinculin结合:免疫荧光双染talin和vinculin,在荧光显微镜下观察,检测talin和vinculin的结合。（8）免疫共沉淀检测talin与vinculin结合:运用双向免疫共沉淀talin和vinculin后,用Western blot进行分析。（9）微量热泳（MST）检测talin与vinculin结合:荧光标记恒定浓度的TD,用不同浓度VD进行滴定,同样的,荧光标记恒定浓度的VD,用不同浓度TD进行滴定,通过观察荧光强度曲线判断蛋白结合情况。结果（1）高效液相的分析结果表明,莪术二酮的纯度>97%。（2）1H和13C NMR光谱鉴定结构为莪术二醇。（3）血小板聚集率结果表明,莪术二醇处理后的血小板聚集率降低,与阳性药物对照组替罗非班的聚集率结果呈同一趋势。（4）Western blot结果表明,结构域VD和TD片段成功合成。（5）Western blot结果表明,莪术二酮抑制talin和vinculin的蛋白表达,AMPK和整合素αIIbβ3蛋白的磷酸化。（6）RT-PCR结果表明,莪术二酮抑制talin和vinculin的mRNA表达。（7）免疫荧光双染结果表明,在血小板上莪术二酮抑制talin和vinculin的共定位。（8）免疫共沉淀结果表明,莪术二酮抑制了talin和vinculin的结合作用。（9）微量热泳结果表明,莪术二酮抑制了talin和vinculin的结合作用。结论在本研究中我们探寻了凝血酶作为诱导剂,莪术二酮抑制血小板聚集的作用机制,发现莪术二酮通过调节AMPK-vinculin/talin-整合素αIIbβ3信号通路发挥抗血小板聚集的作用,以上结果表明其作为民族药物对于血栓性疾病的防治潜力。