雄性绵羊SYCE1基因的克隆、表达定位及其功能的初步验证

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Ar_meng
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联会复合中心组分蛋白1(Synaptonemal complex central element protein1,SYCE1)该基因是组成联会复合体(Synaptonemal complex,SC)的主要成员,且对动物生殖发育具有非常重要的影响。雄性动物的生殖系统相对复杂,分泌激素、产生精子和成熟等功能主要由下丘脑-垂体-睾丸轴支撑,其次与各种参与的调节蛋白密切相关。本研究以雄性绵羊为研究对象,通过RT-PCR克隆绵羊SYCE1基因序列并对序列进行分析;利用qRT-PCR、Western blotting、免疫组化等技术分析SYCE1在绵羊下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中及不同发育阶段(40日龄、3月龄和12月龄)睾丸中的表达情况;以绵羊睾丸支持细胞为研究对象,通过转染pEGFP-C1-SYCE1载体和siRNA-SYCE1载体进行SYCE1基因的功能验证。结果发现:1、绵羊SYCE1该基因CDS全长972 bp,为非跨膜可溶性不稳定蛋白,编码274个氨基酸残基;SYCE1基因在不同种间进化中高度保守。2、SYCE1在绵羊附睾(头、体、尾)、睾丸、下丘脑和垂体各组织中mRNA和蛋白上均有表达,其在睾丸中的mRNA和蛋白表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。3、SYCE1在绵羊不同年龄阶段(40日龄、3月龄、12月龄)睾丸组织中mRNA和蛋白上均有表达,且随着绵羊年龄的增长,SYCE1 mRNA和蛋白水平的表达量均呈增加趋势,12月龄时的表达量最高(P<0.01)。4、通过构建pEGFP-C1-SYCE1过表达载体,合成siRNA-SYCE1沉默载体,分别对支持细胞进行转染,pEGFP-C1-SYCE1 mRNA和蛋白在各时间点表达量均上升,siRNA-SYCE1组mRNA和蛋白在各时间点表达量均下降。通过流式和CCK8检测细胞的增殖状况,过表达组在各时间点的支持细胞增殖率均显著高于空载体组。沉默组的支持细胞增殖率在各时间点均低于NC组,但差异不显著。增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的mRNA表达量随着SYCE1基因在绵羊睾丸支持细胞的过表达和沉默,分别升高和下降。以上结果表明SYCE1蛋白与绵羊睾丸生长发育及精子发生有关,推断其参与雄性绵羊生殖轴调控,为进一步研究SYCE1与生殖细胞及精子生成的关系及其作用机制提供科学依据。
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