肺癌是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率在我国及全球范围内均居所有恶性肿瘤的首位。目前肺癌的主要治疗方式为手术切除、化学治疗、放射治疗、靶向治疗及免疫治疗等。从临床治疗的角度出发,结合生物学特性可将肺癌分为两大类:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。近年来,肺癌发病的疾病谱已发生变化,鳞癌作为之前发病率最高的病理类型,其地位已逐渐被腺癌所取代。腺癌的生物学特点是容易远处转移和复发,其发病率约占非小细胞肺癌的50%,而非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%。而大部分NSCLC患者就诊时临床分期较晚,常伴有局部侵犯或远处转移,虽然包括外科手术在内的各种治疗手段在NSCLC的治疗中发挥着重要作用,但临床疗效仍不容乐观,5年生存率不超过20%。早期诊断和早期治疗能有效预防NSCLC复发和转移的发生,有助于提高患者生存率,改善其生存质量。目前有大量的研究致力于NSCLC的早期诊断和早期治疗,但NSCLC的发生是多因素共同影响的复杂生物学过程,其发病机制尚不明确。因此,探索NSCLC发生过程中的异常基因,识别调控细胞增殖、凋亡的关键分子,成为研究NSCLC发病机制的核心环节。淀粉样前体蛋白结合蛋白 2(Amyloid precursor protein-binding protein 2,APPBP2)基因位于17q21-q24区,编码蛋白可以与淀粉样前体蛋白(APP)特异性结合,参与APP的胞内转运和分泌活动。淀粉样前体蛋白(APP)是一种在多种组织中表达的膜内在蛋白,并且集中在神经元的突触。近年来研究发现,APP与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。研究证实APP可促进脑胶质瘤的发生。有研究发现APP在胰腺癌中的表达明显上调;同时,研究者在胰腺癌细胞的体外培养液中发现了 APP的裂解片段sAPP,阻断sAPP可抑制胰腺癌细胞的增殖,提示APP在胰腺癌的发病中发挥促进作用。其他研究提示,APP与口腔癌、结肠癌的发病密切相关。由此可见,APP参与多种恶性肿瘤的病理生理过程。APPBP2是一种亲水的微管蛋白,除了调控APP的转运和分泌外,亦能与微管特异性结合,影响微管的活动和功能。微管是构成细胞骨架的主要成分,存在于所有的真核细胞中,参与组装纺锤体、中心粒、鞭毛、神经管等多种结构,在维持细胞形态、细胞迁移、细胞有丝分裂、胞内物质输送及信号传导等生物学过程中具有重要调节功能。微管在细胞分裂前期聚合成为纺锤体,纺锤体在细胞有丝分裂过程中牵引染色体向两极移动进入两个子细胞中,从而完成细胞增殖过程。因此,微管在肿瘤细胞的增殖过程中发挥非常关键的作用。APP和微管在恶性肿瘤的发病中均扮演重要角色,而二者的活动和功能均受APPBP2影响,由此推测,APPBP2亦有可能参与恶性肿瘤的发生过程。研究证实,APPBP2与卵巢透明细胞癌的恶性表型及预后密切相关。在乳腺癌的研究中发现,APPBP2在癌组织中的表达明显上调,进而参与乳腺癌的侵袭过程。另外,在神经母细胞瘤内APPBP2基因拷贝数明显高于癌旁组织,而在促纤维增生型髓母细胞瘤中也处于扩增状态。由此可见,APPBP2在多种恶性肿瘤的发病机制中发挥作用,但其在肺癌尤其是NSCLC发病中的作用尚不清楚。因此,本课题重点研究APPBP2在NSCLC发生中的影响和可能的分子机制。[目的]1.明确APPBP2基因与非小细胞肺癌的临床相关性;2.阐明APPBP2基因在非小细胞肺癌发生中的作用;3.揭示APPBP2基因促进非小细胞肺癌增殖、侵袭的分子机制。[方法]1.APPBP2基因与非小细胞肺癌的临床相关性检测基于GEO-LAUD数据阵列分析APPBP在NSCLC中的表达。(1)收集配对肺腺癌及癌旁组织样本。(2)采用RT-PCR技术,检测肺腺癌及癌旁组织中APPBP2-mRNA水平。(3)采用蛋白印迹(Western Blotting,WB)以及免疫组化技术,检测肺腺癌及癌旁组织中APPBP2蛋白表达。2.APPBP2基因在非小细胞肺癌发生中的功能学检测2.1构建APPBP2基因RNAi慢病毒载体(1)针对APPBP2基因序列,设计多个RNA干扰靶点序列。(2)合成含干扰序列的双链oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上;(3)筛选出能有效降解APPBP2基因的RNAi干扰载体。(4)将有效干扰载体以及对照组载体分别包装成sh-APPBP2慢病毒以及sh-NC慢病毒,并通过滴度测定进行质控。2.2 RNAi病毒感染H1299细胞(1)处于对数生长期的H1299细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液。(2)细胞贴壁后,将细胞悬液接种于6-well中。(3)根据细胞MOI值,加入适宜量的sh-NC或sh-APPBP2病毒载体。(4)采用qPCR及Western-blot技术检测APPBP2基因敲减效率。2.3 APPBP2基因对扣299细胞增殖、迁移、凋亡及成瘤能力的影响(1)采用sh-APPBP2慢病毒载体敲除H1299细胞内APPBP2基因(KD组),对照组感染sh-NC慢病毒(NC组)。(2)采用BrdU法、MTT法检测两组细胞增殖情况。(3)采用细胞克隆形成试验,检测两组细胞成瘤能力。(4)采用PI流式法检测两组细胞周期情况。(5)采用Annexin V流式法检测两组细胞凋亡情况。(6)采用Transwell小室及划痕实验检测两组细胞迁移以及侵袭能力。2.4在肺腺癌细胞株A549中重复2.1.2～3实验内容,进一步研究APPBP2的生物学功能。2.5裸鼠成瘤实验(1)培养sh-APPBP2及sh-NC感染NSCLC,配制成细胞悬液。(2)将两组细胞悬液分别接种至裸鼠右前肢腋下。(3)5～7天后观察荷瘤情况,肿瘤形成后测量瘤体大小。(4)28～30天后处死小鼠,取瘤体称重。(5)比较实验组和对照组瘤体体积和重量差异。3.探索与APPBP2基因密切相关的信号通路3.1筛选APPBP2关联基因(1)TCGA-LAUD数据阵列筛选APPBP2相关联基因。(2)在NSCLC样本中对APPBP2与候选基因进行临床相关性验证。(3)采用sh-APPBP2慢病毒载体敲除H1299细胞内APPBP2基因(KD组),对照组感染sh-NC慢病毒(NC组)。(4)采用RT-PCR以及WB检测H1299细胞中APPBP2对关联基因的调控。3.2利用免疫共沉淀技术(co-IP)研究APPBP2与关联基因之间的结合关系。3.3利用Gain-of-function遗传学策略研究关联基因对APPBP2生物学功能的介导作用(1)在sh-APPBP2慢病毒感染H1299细胞以及sh-NC慢病毒感染H1299细胞内过表达关联基因。(2)采用细胞克隆形成试验,检测关联基因在调控APPBP2敲减H1299细胞成瘤能力。(3)采用MTT试验,检测关联基因在调控APPBP2敲减H1299细胞生长能力。(4)采用Annexin V流式法检测关联基因在调控APPBP2敲减H1299细胞凋亡情况。(5)采用Transwell小室实验,检测关联基因在调控APPBP2敲减H1299细胞迁移以及侵袭能力。3.4在sh-APPBP2感染以及sh-NC感染A549细胞中重复3.1(3)～3.3实验内容,进一步验证关联基因在介导APPBP2生物学功能方面发挥的作用。[结果]本研究利用生信分析、免疫组化、荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western blot)在非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中检测APPBP2,PPM1D和SPOP的表达,结果表明与癌旁正常组织相比,三者在非小细胞肺癌组织中表达均明显增高,APPBP2与PPM1D和SPOP表达水平呈正相关。细胞功能学实验表明APPBP2高表达能明显促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,但抑制非小细胞肺癌细胞凋亡。敲低APPBP2降低了非小细胞肺癌中PPM1D和SPOP的表达,抑制肺癌细胞增殖,但在体外诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。沉默APPBP2表达则抑制非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭,减少体内非小细胞肺癌的生长。另外,PPM1D和SPOP的过表达可以显著减弱APPBP2敲低对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制。[结论]本研究结果表明APPBP2的表达水平与非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭呈正相关。APPBP2通过调节PPM 1D和SPOP信号通路促进非小细胞肺癌的进展。本研究不仅为非小细胞肺癌的发生提供了一种新的分子机制,并支持APPBP2作为适合非小细胞肺癌诊断和治疗干预的潜在有价值的分子靶点。