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[目的]:
长期使用糖皮质激素会引起全身明显的骨量丢失而导致骨质疏松及骨折危险性增加。糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)位于骨质疏松发病率的第三位,GIOP是不容忽视的医源性疾病问题。糖皮质激素影响成骨细胞、破骨细胞、骨细胞的分化及功能。大剂量糖皮质激素通过与成骨细胞上特异性受体结合而抑制成骨细胞的增殖、分化及其功能,减少新生骨形成。并且在抑制成骨细胞产生的同时,促使成骨细胞和骨细胞的凋亡,使骨细胞数目减少。Wnt拮抗剂Dickkopf1(DKK1)可通过与Krml/2及LRP5/6结合,阻止Wnt受体复合物Fz/LRP形成,从而阻断经典Wnt信号下传,抑制成骨细胞形成及其活性。DKK1功能的增强与成骨细胞骨形成降低导致骨质疏松密切相关,抑制DKK1是抗骨质疏松的新策略。研究表明,DKK1表达的增加是糖皮质激素抑制成骨细胞的始发原因,阻断DKK1的表达,一方面促进了成骨细胞的定向、分化、发育、增殖,并抑制了其凋亡:另一方面抑制其成脂,促进成骨,增加骨量,对抗糖皮质激素所致的骨形成降低,增加骨量,改善骨质量。目前防治该病的药物作用靶点在于破骨细胞,至今为止,还没有针对糖皮质激素引起骨质疏松症发病机制的治疗方法。本研究建立糖皮质激素性骨代谢异常大鼠模型,观察糖皮质激素(GC)对大鼠骨量和骨微结构的影响,同时研究阻断DKK-1的作用,即应用DKK1抗体对糖皮质激素引起的骨代谢异常模型的作用,观察DKK1抗体对大鼠的骨成分、骨组织形态计量学、骨密度,骨生物力学及相关指标的影响,评价DKK1抗体的体内效应,分析其作用机制和优势。
[方法]:
三月龄雄性SD大鼠52只,随机分成4组,基础组10只,其余三组每组14只。基础组(BAS)未用药,在实验开始即处死;对照组(CON):每日给予蒸馏水5ml/kg灌胃及无菌生理盐水皮下注射5ml/kg一周两次;醋酸泼尼松组(GC):醋酸泼尼松混悬液Smg/kg/d灌胃及无菌生理盐水5ml/kg皮下注射一周两次;抗Dkk1抗体(GC+DKK1-ab)治疗组:醋酸泼尼松混悬液5mg/kg/d灌胃及DKK1抗体30mg/kg皮下注射一周两次。以上药物分为上午给皮下注射无菌生理盐水和抗DKK1抗体,下午给糖皮质激素,共计给药时间为12w。基础组动物在实验开始前即处死。在处死前12、13和2、3天给予钙黄绿素(10mg/kg)皮下注射。正常对照组、醋酸泼尼松组和DKK1抗体治疗组的体内骨组织荧光标记:治疗开始前给予四环素(37.5mg/kg)颈部皮下注射,实验结束时:在动物处死前12、13和2、3天颈部皮下注射钙黄绿素10(mg/kg)。用药结束后心脏抽血处死大鼠,取肾上腺、脾脏、比目鱼肌等计算器官指数,取左侧胫骨,不脱钙包埋,进行行松质骨的骨形态计量学参数测量,取左侧股骨行骨生物力学及骨密度检测。取左股骨及第5腰椎分别测量其骨物理指标、骨重、骨密度(DEXA法)及骨生物力学参数(股骨三点弯曲实验、腰椎体压缩实验),取左侧股骨盐酸消化后ICP等离子体发射光谱法测骨钙,羟脯氨酸试剂盒检测骨羟脯氨酸含量,以此评价实验大鼠骨成分、骨量、骨质量等变化。
[结果]:
1.糖皮质激素(GC)对大鼠组织的影响
1.1 GC对大鼠体重的影响
与CON组比较,GC组大鼠体重增加远低于CON组(p＜0.01)
1.2 GC对骨组织形态计量学的影响
(1)骨形态计量学的表现
①胫骨上段松质骨
a.静态参数变化:大鼠胫骨上段松质骨静态参数显示,GC组骨小梁面积和骨小梁数量较对照组有所增加,其中大鼠胫骨上段松质骨骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)比CON组增加25%(P＜0.05),骨小梁数量(Tb.N)增加18%(P＜0.05),而骨小梁分离度(Tb.Sp)相应降低,不具有统计学意义。
b.动态参数变化:与CON组比较,GC组大鼠胫骨上段动态参数如%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、双荧光周长分别降低了22.2%、24.5%、31.996、29%(P＜0.01&P＜0.05),说明糖皮质激素大鼠成骨活性降低,骨矿化和骨形成作用减弱,骨转化率降低高。与CON组比,骨吸收参数0c.N和%0c.Pm分别增加了45%和47%(P＜0.05)。
②胫骨中段皮质骨
a.静态参数变化:与CON组比较,GC组%Ct.Ar略微增加,%Ma.Ar则稍稍降低(P＞0.05)。
b.动态参数变化:与CON组相比,GC组各种骨形成有关的动态参数有所降低。其中,骨外膜面荧光周长百分数(%P-L.Pm)升高了13.6%(P＞0.05),骨矿化沉积(E-MAR)降低了13.3%,骨形成率(E-BFR/BS)下降了13.8%,但不具统计学意义。
1.3骨重量与骨羟脯氨酸的变化
①骨重量:与CON组比较,GC组大鼠单位股骨的干重减少。
②骨成分:与CON组比较,GC组大鼠羟脯氨酸显著降低P＜0.01(Hyp)
1.4股骨与腰椎各部位骨密度的变化
①股骨:与CON组大鼠比较,GC组大鼠股骨全段BMD几乎无变化,无统计学意义(P＞0.05)。
②腰椎:与CON组大鼠比较,GC组大鼠腰椎全段BMD出现降低,但无统计学意义(P＞0.05)。
1.5骨生物力学性能轻微增加
①股骨:GC组大鼠最大载荷下降(P＞0.05),弹性载荷、断裂载荷、刚性系数不变(P＞0.05)。
②腰椎:GC组大鼠最大载荷不变(P＞0.05)。
2.DKK1抗体对糖皮质激素大鼠骨代谢异常的影响
2.1 DKK1抗体对糖皮质激素大鼠体重的影响
与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠体重增长稍高于GC组大鼠,在12W出现体重增加远大于GC组大鼠(P＜0.05)。
2.2 DKK1抗体对糖皮质激素大鼠骨形态计量学变化
①胫骨上段松质骨
a.静态参数变化:与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠胫骨上段松质骨的骨小梁面积百分率(%Tb.Ar)、骨小梁数量(Tb.N)分别升高了18.2%和11.9%,骨小梁分离度(Tb.Sp)下降了9.7%(P＜0.05);
b.动态参数变化:与GC组比较,GC+DKK1-ab组使%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、分别增加了39.4%、43.0%、52.1%(P＜0.01&P＜0.05)说明抗Dkk1抗体大鼠成骨活性增强,骨矿化和骨形成作用增强,骨转化率升高。与GC组比,骨吸收参数0c.N和%0c.Pm分别减少了56%和51%(P＜0.01)。
②胫骨中段皮质骨
a.静态参数变化:与GC组相比,GC+DKK1-ab组大鼠胫骨中段皮质骨的皮质面积百分数(%Ct.Ar)、骨髓面积百分数(%Ma.Ar)几乎无改变。
b.动态参数变化:与GC组相比,GC+DKK1-ab组骨内膜面荧光周长百分数(%E-L.Pm)、骨形成率(E-BFR/BS)、骨矿化沉积(E-MAR)均有所下降,但不具有统计学意义。
2.3骨重量与骨羟脯氨酸的变化
①骨重量:与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠单位股骨的干重增加,但不具有统计学意义。
②骨成分:与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠羟脯氨酸(Hyp)略降低,变化无统计学意义。
2.4股骨与腰椎各部位骨密度的变化
①股骨:与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠股骨全段BMD出现显著增加(P＜0.01)
②腰椎:与GC组大鼠比较,GC+DKK1-ab组大鼠腰椎全段BMD出现显著增加(P＜0.05)。
2.5骨生物力学性能轻微增加
①股骨:与GC组大鼠比较,最大载荷下降,弹性载荷、断裂载荷、刚性系数等指标均有所恢复,但不具统计学意义(P＞0.05)
②腰椎:与GC组大鼠比较,最大载荷轻微增加(P＞0.05)。
[结论]
1.糖皮质激素引起三月龄雄性大鼠骨小梁面积百分数,骨小梁数量增加,骨小梁分离度降低,然而,显著抑制骨小梁荧光周长百分率,抑制双荧光标记,降低骨形成率,骨基质成分羟脯氨酸含量明显降低,腰椎的骨密度降低。所有骨生物力学性能不能随着骨小梁的增加而增加,说明骨的质量降低。结果表明大剂量糖皮质激素造成骨形成降低,骨质量降低,引起骨代谢异常。
2.DKK1抗体明显对抗糖皮质激素引起大鼠的骨形成抑制,刺激骨形成,增加骨形成率,增加骨小梁面积百分率和骨小梁数目,改善骨的微结构,增加骨密度,恢复骨生物力学性能。研究表明DKKl抗体对糖皮质激素造成的骨损坏方面有较好的防治作用,可能是治疗骨质疏松的理想药物。