血吸虫病是一种严重危害人民身心健康的人兽共患寄生虫性传染病,在我国仍然是一个重要的公共卫生问题。流行病学调查和人工感染实验研究结果表明：东方田鼠Microtus fortis)是日本血吸虫的非适宜宿主,也是唯一一种对日本血吸虫具有天然抗性、感染血吸虫后不致病的哺乳动物。在前期实验的基础上,本研究通过蓝色琼脂糖凝胶亲和层析,直接从东方田鼠血清中分离、纯化获得了一个对日本血吸虫童虫具有显著杀伤作用的蛋白——白蛋白。为了进一步了解东方田鼠血清白蛋白抗日本血吸虫的作用机理,我们用FITC标记东方田鼠血清白蛋白,来追踪其在日本血吸虫童虫体内的作用部位,应用日本血吸虫肠道内的组织蛋白酶Legumain来消化东方田鼠血清白蛋白,并构建了东方田鼠血清白蛋白的真核表达载体,制备条件培养基,验证了其表达产物对日本血吸虫童虫的杀伤效果。ILKAP是本课题组从东方田鼠骨髓细胞cDNA文库中筛选出来的一种抗性基因,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验,联合MALDI-TOF-MS分析,鉴定出与ILKAP作用的8种相关蛋白,接着将基因ILKAP和Tegument antigen (TA)分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)b和pCMV-Tag2b,共转染HEK293T细胞后,通过免疫共沉淀和Western blotting验证了ILKAP和Tegument antigen的相互作用,为进一步阐明其在抗日本血吸虫的作用机制及发现新的抗性相关蛋白提供线索。一、东方田鼠血清白蛋白的分离、纯化、鉴定及对日本血吸虫童虫的杀伤效果实验通过蓝色琼脂糖凝胶层析柱分离得到东方田鼠血清白蛋白溶液,透析、冷冻干燥后,通过10%SDS-PAGE电泳进行分析。将纯化的白蛋白与体外培养的日本血吸虫童虫共孵育,实验结果显示：东方田鼠白蛋白浓度为2.5mg/m1时,童虫死亡率为37.94%(P<0.05),随着白蛋白浓度的增加,童虫死亡率也增加,与对照组相比,具有统计学意义。二、东方田鼠血清白蛋白条件培养基的制备及对日本血吸虫童虫的杀伤效果本实验将东方田鼠白蛋白基因重组到真核表达载体pcDNA3.1(+),制备东方田鼠白蛋白的条件培养基,检测其真核表达产物体外杀伤日本血吸虫童虫效果。实验结果显示：东方田鼠albumin的条件培养基杀虫率为38.7%(P<0.05),与对照组相比具有显著的杀虫效果。三、东方田鼠血清白蛋白在日本血吸虫童虫体内的定位及Legumain对东方田鼠血清白蛋白的消化将荧光素(FITC)标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育,白蛋白终浓度为5mg/ml,于37℃、5%CO2环境中培养童虫。24h及48h后分别收获童虫,于OLYMPUS倒置荧光显微镜下观察荧光出现的部位。结果发现,FITC标记的东方田鼠血清白蛋白与日本血吸虫童虫共孵育24h后,在童虫肠道内有荧光素聚集,孵育48h后,荧光素在童虫肠道内的聚集更加明显。为了进一步了解东方田鼠抗日本血吸虫童虫的作用机制,我们分析了日本血吸虫肠道内常见的几种内肽酶：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L和组织蛋白酶AE。通过文献资料查阅和序列分析发现：只有Legumain对东方田鼠和小白鼠白蛋白的氨基酸序列有切割位点的变化。因此我们利用Legumain分别消化东方田鼠和小白鼠血清白蛋白。结果发现：Legumain对东方田鼠和小白鼠血清白蛋白的消化存在显著差异。四、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的筛选在早期抗日本血吸虫研究中,课题组建立了东方田鼠骨髓细胞cDNA文库,通过表达克隆法对该文库进行抗性基因的筛选,从gE77次级亚基因池中筛选到抗性候选基因gE77.43,其编码的产物为整合素连接激酶相关丝氨酸／苏氨酸磷酸酶(ILKAP)。前期研究首次发现ILKAP具有显著的杀伤日本血吸虫童虫的效果。因此,本研究利用东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白,通过免疫共沉淀实验,联合质谱分析鉴定与8种与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。五、与ILKAP相互作用的日本血吸虫童虫蛋白的验证东方田鼠骨髓蛋白与日本血吸虫童虫蛋白通过免疫共沉淀实验和质谱分析共筛选了8个可能与ILKAP相互作用的血吸虫童虫蛋白质。为进一步验证筛选出来的蛋白质是否与ILKAP存在相互作用,本实验采用免疫共沉淀结合Western blotting发现童虫蛋白TA确实与ILKAP存在直接相互作用。本研究利用脂质体分别将Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b和Flag-ILKAP-pCMV-2b转染至HEK293T细胞,建立ILKAP-Flag和TA-Myc高表达的HEK293T细胞；通过免疫共沉淀实验证实了日本血吸虫蛋白TA与东方田鼠骨髓ILKAP之间的相互作用,为进一步阐明东方田鼠抗日本血吸虫的作用机制及发现新的靶作用位点提供线索。