论文部分内容阅读
甜瓜(Cucumis melo L.)是一种二倍体一年生匍匐草本植物,种类繁多,分布广泛,具有丰富的营养价值和较高的经济效益。典型的呼吸跃变型甜瓜已成为研究果实发育成熟的另一种模式植物,并且由于甜瓜植株的花型多样、花器官大,使之成为研究花器官发育的特色植物材料。1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)是乙烯合成过程中的关键酶,在乙烯的生物合成过程中起到限速作用,在植物的整个生长发育历程中有着非常重要的作用。在本研究中,我们发现CmACS7和CmACS11可能通过促进乙烯合成和调控果实软化以及糖代谢等过程调控果实成熟。主要研究结果如下:(1)本论文以实验室前期工作中得到的CmACS1、CmACS7和CmACS11的超表达和CRISPR/Cas9基因编辑T1代转基因甜瓜为实验材料进行后续研究。目前已筛选到CmACS7超表达和基因编辑的T4代转基因纯合株系,CmACS11超表达T4代转基因纯合株系。利用实时荧光定量法分析了不同的T4代转基因株系甜瓜果实中目的基因的表达量,结果显示,与野生型相比较,CmACS1转基因甜瓜中有2个超表达株系的CmACS1表达量上调,3个编辑株系的表达量下调;CmACS7转基因甜瓜中有1个超表达株系的CmACS7表达量上调,3个编辑株系的表达量下调;CmACS11转基因甜瓜中有2个超表达株系的CmACS11表达量上调,3个编辑株系的表达量下调。(2)表型观察结果显示,CmACS1、CmACS7、CmACS11的超表达幼苗均表现出根和下胚轴的伸长受到抑制,且顶钩弯曲度增大等乙烯三重反应表型,这表明其可能通过促进了乙烯的合成。CmACS7超表达转基因植株中出现了植株矮小、叶片面积减小、花器官发育缓慢等表型。同时,CmACS1、CmACS7和CmACS11的T4代超表达转基因果实较野生型果实早熟5天左右,而编辑果实较野生型晚熟11天左右。(3)对CmACS1、CmACS7和CmACS11的T4代转基因甜瓜的果实成熟相关生理指标的测定结果显示,CmACS1、CmACS7和CmACS11超表达和编辑果实的大小、重量和纵横径没有明显差别,但CmACS1、CmACS7和CmACS11超表达果实的硬度相较于野生型显著下降,编辑果实的硬度相较于野生型显著上升,并且超表达果实的糖度相较于野生型显著提高。说明CmACS7和CmACS11能够促进甜瓜果实的成熟,并且可能通过促进乙烯合成和调控果实软化以及糖代谢等过程调控果实成熟。(4)为了研究CmACS7和CmACS11发挥其功能的分子机制,对其进行了亚细胞定位检测,结果显示,CmACS7和CmACS11均定位于内质网。(5)根据启动子预测序列信息,通过酵母单杂交筛选获得了与CmACS11基因相互作用的与花发育相关的转录因子CmPI,这表明CmACS11可能受到CmPI转录因子的调控从而影响花的发育。同时,选取可能与CmACS11相互作用的果实成熟相关转录因子进行酵母单杂交验证,目前已成功克隆了CmMADS1、CmNAC2、CmNAC29、CmRAV2以及含有其与CmACS11结合位点的启动子及其突变体,并构建了相应的pAbAi-Bait和pGADT7-CmMADS1、pGADT7-CmNAC2、pGADT7-CmNAC29、pGADT7-CmRAV2等12个载体并转化了酵母且筛选到抑制AbAr基因表达的最低AbA浓度。以期找到调控CmACS11基因表达的转录因子,进而分析通过乙烯途径调控甜瓜果实成熟的分子机制。