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目的:随着世界范围内糖尿病人数的不断增长,糖尿病肾病(DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一,已成为引起终末期肾病的主导因素。肾小球足细胞为特异性终末分化细胞,在维持肾小球滤过屏障组成和功能上起到关键作用。本文以肾脏足细胞为研究对象,首先通过整体动物实验观察生地、山茱萸环烯醚萜苷(RI、CI)对糖尿病肾脏足细胞的保护作用,其次通过体外细胞实验探讨RI、CI特征成分保护晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导小鼠足细胞(MPC)损伤的作用机制,从而为DN的治疗提供新的方法与思路。方法:整体动物实验:取体重160-180 g雄性6周龄Wistar大鼠,高脂饲养8周,同时设空白对照组大鼠喂养普通饲料。将高脂喂养的大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)进行造模,将造模大鼠继续高脂饲养,4周后选取空腹血糖≥16.7 mmol/L以及24 h尿蛋白>15 mg为DN模型动物。将成模动物按空腹血糖值随机分为4组,分别为模型组、卡托普利组(20 mg/kg)、山茱萸环烯醚萜苷(CI)组(30mg/kg)、生地环烯醚蔽苷(RI)组(60 mg/kg),各给药12周,测定指标:(1)每3周测定大鼠血糖、饮食量、饮水量、尿量及体重等。(2)每3周测定大鼠肾功能相关指标:尿蛋白、尿肌酐、肾脏AGEs。(3)末次给药后大鼠脱颈椎处死,分离肾脏,部分肾脏分别用10%福尔马林溶液或2.5%的戊二醛中固定,测定如下指标:用透射电镜观察大鼠肾小球足细胞超微结构的变化;免疫荧光检测肾小球足细胞WT-1的表达;免疫组化检测足细胞Desmin、Nephrin的表达。体外细胞实验:(一)AGEs致足细胞损伤模型的建立:体外培养小鼠肾小球永生化足细胞株,未分化的小鼠肾小球足细胞先在33℃、5%CO2培养箱中使其传代增生,然后在37℃、5%CO2培养箱中培养7～14 d使其分化成熟。待细胞分化成熟后,选用不同浓度AGEs(50、100、200、400 mg/L)和不同时间(6、12、18、24 h)刺激,同时设空白对照组以及阴性对照组(0-BSA)。IncuCyte ZOOM动态活细胞成像及分析系统观察不同时间细胞状态;MTT法检测细胞OD值;Hoechst33342/PI染色检测细胞凋亡状况;Western-blot检测足细胞Desmin、ILK、Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的蛋白表达。(二)生地、山茱萸环烯醚萜苷类成分干预AGEs致足细胞损伤的机制研究:基于AGEs诱导足细胞损伤模型,加入不同浓度(10、1、0.1 μmol/L)RI、CI干预。动态活细胞成像系统观察不同时间细胞状态;MTT法检测细胞OD值,根据公式计算存活率;AO/EB法检测细胞损伤状况;ELISA法检测细胞上清FN、LN、Col-Ⅳ含量;Westem-blot检测足细胞 ILK、Bax、Bcl-2 及 Cleaved caspase-3 蛋白表达。结果:整体动物实验:模型组大鼠体现出典型的多饮、多食、多尿、体重减轻、高血糖及肾脏损伤等症状,而RI、CI能够显著改善DN大鼠“三多一少”症状(P<0.05,P<0.01),降低血糖(P<0.05,P<0.01),提高尿肌酐水平,降低尿蛋白、肾脏AGEs水平(P<0.05,P<0.01),改善肾小球足细胞形态,减少肾小球足细胞损伤标志蛋白Desmin表达以及上调足细胞特异性蛋白Nephrin和 WT-1 的表达(P<0.05)。体外细胞实验:(一)AGEs致足细胞损伤模型的建立:①AGEs 50 mg/L组在12、18 h对足细胞具有抑制作用(P<0.05),但效果不显著,在24 h时能显著抑制细胞生长(P<0.01),降低细胞存活率;AGEs 100、200、400 mg/L组在刺激12、18、24 h对足细胞生长具有显著的抑制作用(P<0.01),且呈剂量、时间依赖性关系。②IncuCyte ZOOM动态活细胞成像系统观察发现细胞在24 h时AGEs 100、200、400 mg/L组细胞损伤较严重,胞质外溢,形态较差;在12、18 h时AGEs 200、400 mg几组损伤较为严重,细胞出现坏死。(③)Hoechst染色结果显示空白对照组与0-BSA组足细胞发出低蓝/低红色荧光,细胞形态无明显改变;AGEs在浓度为50、100、200 mg/L时,细胞随浓度的增加大部分发出高蓝/低红色荧光,细胞膜通透性增强,呈细胞凋亡形态改变;当AGEs浓度为400 mg/L时,细胞大部分发出低蓝/高红色荧光,呈坏死形态。④WB结果显示 AGEs 能不同程度上调 ILK、Desmin、Bax/Bcl-2 及 Cleaved caspase-3 的表达。(二)生地、山茱萸环烯醚萜苷类成分干预AGEs诱导足细胞损伤的机制研究:①MTT结果显示当马钱苷、梓醇在终浓度为0.1、1μmol/L时,莫诺苷、毛蕊花糖苷终浓度在0.1、1、10 μmol/L时对AGEs损伤足细胞具有一定的保护作用(P<0.05,P<0.01)。其中以马钱苷(1μmol/L)、莫诺苷(10μmol/L)、毛蕊花糖苷(10μmol/L)保护作用最强。②马钱苷、莫诺苷、毛蕊花糖苷及梓醇均能不同程度增加细胞LN、FN、Col-IV等黏附因子表达,与模型组相比具有差异显著(P<0.05,P<0.01)。③生地、山茱萸环烯醚萜苷类特征成分均能下调足细胞ILK、Bax、Cleaved caspase-3等蛋白的表达,与模型组比较差异显著(P<0.05,P<0.01)。结论:实验结果表明RI、CI能够明显降低糖尿病肾病大鼠血糖,减轻糖尿病症状,减少蛋白尿,改善肾小球足细胞损伤,其作用机制可能与增加足细胞黏附性,减少足细胞脱落以及抑制足细胞凋亡等有关。