第一部分:胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及其受体（RET）在腹泻型肠易激综合征患者结肠粘膜中的表达改变及与症状的相关性分析研究背景和目的:肠易激综合征（Irritable bowel syndrome,IBS）的特征表现为腹痛、腹胀、排便次数和性状改变,是常见的功能性胃肠病,病人常伴焦虑抑郁等精神症状。IBS的病理生理基础主要涉及内脏高敏感、胃肠动力异常、菌群紊乱、精神心理应激等,然而其具体病理生理机制尚不清楚。根据排便习惯和排便性状改变,罗马Ⅳ标准将IBS分为四种亚型,分别为腹泻型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、不定型（IBS-U）和混合型（IBS-M）,其中IBS-D发病率、诊断率较高而受到广泛关注。目前研究发现,肠神经营养因子对肠道上皮的改变可能导致IBS和IBS症状,IBS-D的神经-免疫-内分泌网络逐渐受到重视。肠胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）在肠道主要由肠胶质细胞分泌,GDNF结合共受体GFRα-RET并激活RET的胞内部分使其磷酸化,实现信号转导。通常认为肠道的RET表达于神经细胞,然而最近的研究发现,在果蝇和小鼠的肠内分泌细胞中特异性的表达RET。肠嗜铬细胞（Enterochromaffin cells,EC cells）是肠上皮中的一种重要的神经内分泌细胞,尽管只占肠上皮细胞数量的1%,但是分泌了体内约95%的5-HT。EC细胞及分泌的五羟色胺（5-HT）在IBS内脏高敏感的发生和发展过程中发挥着非常关键的作用,IBS-D病人的餐后血浆中5-HT水平升高,粘膜下或肌间神经丛上存在的5-HT受体,二者结合后可增加胃肠道运动、导致内脏高敏感等。然而GDNF/RET在人肠道上皮组织中的具体分布目前尚无研究,GDNF/RET在IBS-D中的调控作用目前尚不清楚。本研究的主要目的是探讨GDNF及其受体RET在IBS-D结肠粘膜中的具体分布和表达改变以及与疾病症状之间的相关程度。我们首先检测了IBS-D患者结肠粘膜GDNF的蛋白表达水平,并将其与焦虑抑郁评分和患者的腹部症状评分进行关联性分析;免疫组化染色分析IBS-D结肠粘膜的EC细胞数量,将GDNF与EC细胞数目做相关性分析;最后通过免疫染色的方式检测GDNF/RET在人的结肠上皮中的定位。研究方法:（1）IBS-D患者及对照:根据功能性胃肠病罗马Ⅳ标准纳入IBS-D患者1 1例,正常对照者12例,在结肠镜下采集直乙交界处活检粘膜。患者和对照均采集HADS汉密尔顿焦虑抑郁量表以及IBS-SSS量表。（2）酶联免疫标记法（Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA）检测IBS-D患者和对照肠粘膜中GDNF的蛋白表达水平。（3）计算GDNF水平与HADS焦虑评分、抑郁评分以及IBS-SSS腹痛评分之间的相关性。（4）免疫组织化学方法检测IBS-D患者和对照结肠粘膜中GDNF、ChgA、5-HT的表达,统计神经内分泌细胞和EC细胞数目,计算IBS-D患者EC细胞表达差异,计算GDNF表达水平与EC数目的相关性。（5）免疫免疫荧光和免疫组化方法检测IBS-D患者和健康对照结肠粘膜中GDNF/RET在EC细胞的表达和定位。研究结果:（1）IBS-D患者EC细胞数量较正常人增多。IBS-D病人的焦虑评分和抑郁评分相比健康对照显著提高,在IBS-D患者中,焦虑抑郁病人约占70%。患者和对照中男女比例、年龄、BMI均无统计学差异。免疫组化结果显示:ChgA阳性细胞数目在IBS-D患者中显著升高,其中5-HT阳性细胞数目也显著增多。（2）IBS-D患者结肠粘膜GDNF的表达水平较正常人升高。ELISA结果显示:IBS-D患者结肠粘膜GDNF蛋白水平相比正常对照者显著增高（P<0.05）。免疫组化结果显示:IBS-D患者结肠粘膜GDNF阳性染色的细胞数量相比健康对照明显升高,并且GDNF在特定上皮细胞中染色强阳性,散在分布于肠上皮细胞中。（3）GDNF表达水平与EC数目正相关。GDNF表达水平与EC细胞数目呈正相关,推测GDNF与EC细胞相关。GDNF与焦虑评分和抑郁评分并无相关性。GDNF与IBS-SSS腹痛评分也无明显相关性。（4）GDNF/RET表达在人结肠上皮细胞的EC细胞中。在IBS-D患者和对照的结肠中,连续石蜡切片免疫组化显示,GDNF和5-HT有部分重叠,提示GDNF储存于EC中。免疫荧光光共标结果表明,在IBS-D患者和对照中,RET和ChgA均存在共位表达,提示RET在人结肠上皮中存在并表达在EC中。结论:（1）IBS-D患者结肠粘膜GDNF含量显著增多,GDNF水平与焦虑抑郁评分和IBS症状的腹痛评分无显著相关。（2）IBS-D患者结肠粘膜EC细胞数目增多,GDNF水平与EC细胞数目呈正相关。（3）GDNF在IBS-D患者和正常人的结肠粘膜的EC细胞富集,GDNF受体RET在肠道上皮主要定位于EC细胞。第二部分:GDNF/RET通路促进肠干细胞增殖分化调控肠易激综合征的机制研究研究背景和目的:肠易激综合征（Irritablebowel syndrome,IBS）是以慢性反复发作的腹痛伴排便频率和性状改变为特征的功能性胃肠病,但目前尚无特征性病理生理和生化改变。大量研究表明,内脏高敏感性是导致腹痛的主要基础,但其病理生理机制尚不清楚。本研究第一部分发现,胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）在IBS患者结肠粘膜中显著增加,GDNF及其共受体RET在结肠上皮中定位于EC细胞,GDNF与EC细胞数目呈正相关。EC细胞作为一种终末分化的细胞,无法分化复制,因此我们推测EC数目的增加来自于肠干细胞（Intestinalstemcell,ISC）增殖活化以及ISC向EC细胞的分化比例增多,这成为本研究第二部分的主要研究内容。EC作为肠道微环境的“化学感受器”,检测肠腔中的多种化学分子,并且作出反应。IBS-D病人的结肠粘膜5-HT含量增多,推测5-HT释放量增加,结合表达5-HT受体的粘膜下或肌间神经丛,在胃肠道运动、内脏高敏感等方面发挥着重要作用。临床上采用5-HT3受体抑制剂和5-HT4受体抑制剂治疗腹泻型IBS和便秘型IBS,然而心血管副作多,因此探讨ISC向EC转化的具体生理病理机制可以为新的靶点药物提供理论基础。GDNF属于GDNF家族,在肠道主要由肠胶质细胞分泌。RET是一种跨膜酪氨酸激酶受体,GFR/RET/GDNF复合物使RET胞内酪氨酸激酶磷酸化,进一步活化下游信号通路。GDNF/RET不仅参与神经细胞的生长修复和神经前体的生长,还参与输尿管芽的形成和精原干细胞的分化。在胰腺,GDNF可以促进胰岛β细胞的增殖和分化。最新研究表明,在RET表达在小鼠和果蝇的肠道EC细胞中,体外RET突变的小鼠小肠类器官出芽率明显降低。GDNF/RET序列保守且参与多种器官的干细胞增殖分化调节,我们猜想GDNF/RET是否调节ISC增殖分化,并最终导致EC细胞数目变化?为了验证以上猜想,本研究主要从以下几个内容进行研究:1.建立内脏高敏感小鼠模型,给予造模RET抑制剂灌胃以确定GDNF是通过RET受体而不是其他受体发挥作用,检测EC细胞数量和干细胞增殖分化相关指标。2.野生型小鼠给予GDNF刺激,检测内脏高敏感情况,EC细胞数目以及干细胞增殖分化相关通路。3.体外肠道类器官培养,给予GDNF和RET抑制剂孵育,检测5-HT分泌情况,以及干细胞Wnt通路情况和EC细胞分化的关键转录因子。研究方法:（1）本研究采取急性束缚应激（Wrap restraint stress,WRS）模型,WRS是一种无溃疡性结肠高敏感模型。小鼠模型构建成功后,给予RET抑制剂灌胃。另外野生型小鼠给予GDNF腹腔注射,记录AWR评分（2）qPCR方法检测结肠Axin2、Lgr5、Sox9、Cd44、Ngn3、Tph1和GDNF的mRNA表达水平。Western blot检测以上基因的蛋白表达水平。（3）免疫组化方法检测小鼠结肠EC数量变化,免疫荧光检测分析小鼠结肠干细胞增殖水平。（4）体外培养小鼠小肠和结肠类器官,分别给予GDNF和GDNF+RET抑制剂处理,分析表面积和出芽率。免疫荧光检测β-catenin的表达水平。ELISA检测类器官上清中5-HT的表达水平。qPCR检测干细胞增殖分化相关指标。结果:（1）GDNF/RET激活增强小鼠内脏敏感性WRS小鼠内脏敏感性显著提高,在RET抑制剂灌胃后,内脏敏感性显著降低,但仍高于正常对照小鼠;GDNF腹腔注射的正常小鼠内脏敏感性显著升高,表型与WRS相似。结果提示GDNF激活RET受体在体内可增加小鼠的内脏敏感性。（2）GDNF/RET激活增加小鼠结肠EC细胞数目WRS处理后,小鼠结肠的EC细胞数目显著增多。给予WRS小鼠RET抑制剂灌胃后,小鼠结肠的EC细胞数目将低至正常水平。正常小鼠接受GDNF腹腔注射处理后,结肠粘膜EC细胞数目较生理盐水腹腔注射显著增多。（3）体内实验中GDFN/RET对小鼠干细胞转录水平的影响qPCR结果显示,WRS小鼠和GDNF腹腔注射的正常小鼠结肠Axin2、Lgr5、Sox9、Cd44、Ngn3、Tph1和GDNF指标均显著升高,RET抑制剂灌胃后可中和其作用,提示GDNF/RET可促进结肠干细胞的增殖分化。（4）体内实验中GDNF/RET对小鼠肠干细胞蛋白水平的影响。WRS小鼠结肠GDNF含量显著高于对照组（P<0.01）,且RET抑制剂可降低GDNF含量。WRS小鼠结肠粘膜的NGN3表达量显著高于对照组（P<0.05）,RET抑制剂也可抑制此效应。WRS小鼠结肠粘膜的LGR5、TPH1、β-catenin和RET的表达均有升高,然而升高不显著。GDNF腹腔注射小鼠结肠粘膜中,RET受体表达量显著升高（P<0.05）,β-catenin表达量显著升高（P<0.01）,Ngn3表达量也显著升高（P<0.05）。虽然LGR5和TPH1表达量也有升高,但是均不显著。免疫荧光结果显示,WRS和GDNF处理均可增强结肠上皮β-catenin的表达,RET抑制剂可降低WRS的效应。（5）GDNF-RET对肠类器官的影响100nmol/LGDNF孵育后,小肠和结肠类器官的面积和出芽率显著提高,RET抑制剂预孵育之后拮抗了 GDNF的作用。免疫荧光染色结果显示,GDNF体外刺激小鼠小肠和结肠类器官导致β-catenin表达增强。RET抑制剂预孵育的小肠和结肠类器官荧光信号明显减弱。（6）GDNF/RET促进结肠类器官的干细胞成熟不同浓度的GDNF（50nmol/L,100nmol/L和200nmol/L）和RET抑制剂对类器官刺激后,小肠类器官上清中5-HT变化无统计学差异。100nmol/L GDNF可显著增高结肠类器官5-HT水平,然而50nmol/L和200nmol/L GDNF对结肠类器官分泌的5-HT水平无显著差异。RET抑制剂预孵育结肠类器官1小时后,再次给予100nmol/LGDNF,5-HT浓度较无RET抑制剂预刺激显著减低。qPCR结果显示,不同浓度GDNF处理对小肠类器官的Tph1、Ngn3和NeuroD表达无显著差异,但100nmol/LGDNF可以增加Axin2、Lgr5、Sox9的表达,RET抑制剂可拮抗GDNF对以上基因的增加。与小肠不同的是,100nmol/LGDNF可显著提高结肠类器官中Tph1、Ngn3、NeuroD、Axin2、Lgr5和Sox9的表达,RET抑制剂可拮抗以上效应。结论:（1）WRS小鼠结肠组织GDNF/RET表达明显升高,结肠粘膜EC细胞数目显著增加,ISC增殖增多,向EC细胞分化的通路表达升高,RET抑制剂可拮抗以上表型,降低小鼠内脏高敏感。（2）GDNF腹腔注射小鼠结肠粘膜EC细胞数目显著增多,ISC成熟增加,ISC向EC细胞分化的关键因子表达上调,进而导致内脏高敏感。（3）在体外,GDNF可剂量依赖性的增加结肠类器官分泌5-HT水平,GDNF刺激小肠类器官后,其上清中5-HT表达无显著差异。（4）GDNF/RET可促进类器官的生长成熟,并促进结肠类器官干细胞向EC细胞分化。